Существует необходимость в точном и высокой пропускной способности метода для измерения RSV нейтрализации антител, в качестве важного маркера защиты от респираторно-синцитиального вируса. Этот метод является весьма воспроизводимым с меж-анализ вариаций для ссылки антисемя время менее 10%Мы считаем, что этот анализ может быть легко создана во многих лабораториях по всему миру при относительно низкой стоимости. Мы описываем здесь анализ микролимфлизации на основе изображений, который был протестирован на подгруппе A RSV, а также может быть адаптирован для подгруппы B RSV и различных типов образцов.
Демонстрацией процедуры будет Рубен Цзе, член исследовательской группы MCRI. Для семян пластин в первый день, первый resuspend A549 клеток в DMEM средств массовой информации, с 10%FCS и 1000 единиц пенициллин-стрептомицин смеси в концентрации 400000 клеток на миллилитр. Затем семя 96-ну плоские нижние стерильные пластины с 40000 A459 клеток при плотности 100 микролитров на колодец.
Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислого газа окружающей среды в одночасье. Для подготовки разбавления сыворотки на второй день, сначала оттепель человека RSV ссылки сыворотки и сыворотки тестовых образцов при комнатной температуре. Затем поместите их в ванну для воды при температуре 56 градусов по Цельсию в течение 30 минут, чтобы нагреть и активировать их.
Далее приготовьте более 110 микролитров от одного до 100 разбавления эталонной сыворотки, смешивая 1,5 микролитера эталонной сыворотки с без FCS DMEM-медиа с пенициллин-стрептомициновой смесью до конечного объема в 150 микролитров. Pipette 110 микролитров этого разбавления в хорошо A12 из 96-ну U-нижней стерильной пластины. Чтобы сделать серийный один-два разбавления вниз пластины, сначала добавить 55 микролитров FCS-бесплатных СРЕДСТВ массовой информации DMEM с Пенициллин-Стрептомицин смеси скважин B12 до H12.
Затем с новым наконечником перенесите 55 микролитров из хорошо A12 в колодец B12. Pipette вверх и вниз пять раз, чтобы смешать раствор, и продолжать, пока вы не достигнете хорошо H12. Пипетка от лишних 55 микролитров раствора из хорошо H12.
Затем приготовьте от одного до 100 разбавления образцов теста сыворотки и добавьте 110 микролитров каждого разбавления к соответствующим скважинам A1 к A9 и E1 к E9 из 96-хорошо стерильной пластины. Затем добавьте 55 микролитров fcS-бесплатных СРЕДСТВ массовой информации DMEM с пенициллин-стрептомицин смеси скважин в столбцах от одного до девяти. Сделайте последовательное от одного до двух разбавлений строки A в строку D и из строки E в строку H, как описано ранее.
Добавьте 55 микролитров средств массовой информации DMEM без FCS со смесью пенициллин-стрептомицин в скважины колоннами 10 и 11. Чтобы подготовить вирусный запас, сначала положите замороженный флакон RSV в водяную ванну 37 градусов по Цельсию, чтобы быстро разморозить ее, а затем поместите флакон на лед. Затем добавьте вирус в DMEM-средства массовой информации, содержащие смесь пенициллин-стрептомицин, примерно в 200 ПФУ на скважину, чтобы сделать общий объем 55 миллилитров для 100 скважин.
Чтобы подготовить смесь сыворотки вируса, сначала добавьте 55 микролитров разбавленного вируса во все скважины столбцов от одного до девяти и колодцы рядов E через H столбцов 10 и 11. Затем добавьте 55 микролитров FCS-бесплатных СРЕДСТВ массовой информации DMEM с пенициллин-стрептомицин смесь для всех скважин рядов D колонн 10 и 11, и инкубировать пластины при 37 градусов по Цельсию в 5%углекислого газа окружающей среды в течение одного часа. До прививки клеток A549 с RSV, изучить клеточной пластины под световым микроскопом, чтобы подтвердить, что A549 клеток монослойных 80%confluent.
Затем инвертировать пластину осторожно, чтобы отбросить средства массовой информации, и слегка пятно пластины на стерильных абсорбентное бумажное полотенце. После каждого, мыть с фильтрованной стерильной PBS. Затем добавьте 100 микролитров на колодец смеси сыворотки вируса к соответствующим скважинам на клеточной пластине A549 в соответствии с шаблоном пластины, предусмотренным в рукописи, и инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислом газе в течение одного часа.
В конце инкубации используйте пипетку для удаления 90 микролитров на колодец и добавьте 100 микролитров мультимедиа, содержащих смесь 1XM199, 1,5%CMC и 2%FCS в смеси пенициллин-стрептомицин. Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислого газа в течение трех дней. Чтобы исправить и разработать анализ пластины, сначала инвертировать RSV-инфицированных A549 клеточной пластины мягко отказаться от средств массовой информации, содержащей M199, CMC, 2%FCS, и пенициллин-стрептомицин смеси.
Затем медленно добавьте 200 микролитров Fixation Buffer к каждой колодец. Инкубировать пластину при температуре минус 20 градусов по Цельсию в течение 20 минут. Затем отбросьте буфер фиксации и аккуратно помарку на абсорбентное бумажное полотенце.
Оставьте тарелку лицом вниз, чтобы высохнуть в течение 10 минут. Затем с фильтрованным буфером PBS, содержащим 05 полисорбата 20, сделайте 5%молочный блокирующий раствор. Добавьте 200 микролитров блокирующего раствора к каждой колодец и инкубировать пластину при комнатной температуре в течение 30 минут.
В конце инкубации инвертировать пластину осторожно, чтобы отказаться от раствора и пятно на абсорбентное бумажное полотенце. Чтобы сделать первичное антитело, разбавить от одного до 500 коз XRSV антитела в блокирующий раствор. Добавьте 50 микролитров к каждому колодец и инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа.
Вымойте пластину три раза с фильтрованным PBS-полисорбатом. Далее, сделать вторичное антитело, разбавляя от одного до 5000 Alexa Fluor осла анти-коза иммуноглобулин G в блокирующий раствор. Добавьте 50 микролитров к каждой колодец и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа.
Вымойте пластину пять раз с фильтрованным PBS-полисорбатом. Для подсчета табличек с автоматическим считывателем пятен сначала используйте неиспользованную культурную пластину 96-ну для совместной работы с инструментом, введя настройки подсчета в канале FITC. Затем прочитайте клеточную пластину, заверните ее в фольгу и храните при четырех градусах цельсия.
Далее проверьте изображения колодцев на наличие артефактных бляшек или нарушенных монослой клеток, а также исключите скважины с нарушенными монослойными ячейками. Среднее количество бляшек не-сыворотки контрольных скважин было рассчитано и использовано для определения 50%-нейтрализации отрезания, что приведет к 50%-ной ингибированию вирусной активности. Взаимное разбавление сыворотки было построено на х-оси и количество бляшек на оси полу-журнала график от линии, нарисованной между двумя точками.
50%-нейтрализации титры тестовых образцов сыворотки были красными и разбавления сыворотки с подсчетами непосредственно выше или ниже 50% значение не-сыворотки контрольных скважин были определены. Анализы RSVAPRN в двух различных взрослых когортах из Гамбии и здоровых добровольцах в Мельбурне привели к тому, что взрослые гамбийцы имеют более низкий средний титр NAB по сравнению со взрослыми мельбурнами. Показанная сыворотка с ссылкой на RSV человека демонстрирует очень низкую изменчивость с коэффициентом вариации 6,82%Это улучшенное высокое содержание пропускной способности RSV анализа нейтрализации бляшек RSV может быть легко реализовано во многих лабораториях, и будет поддерживать международные усилия ВОЗ по гармонизации для анализа RSV нейтрализации антител.
Это будет иметь решающее значение для оценки новых кандидатов вакцины РСВ в будущем.
