Суперкомплексы являются надмолекулярными агрегатами, образованными респираторными цепными комплексами во внутренней митохондриальной мембране. Считается, что формирование этих суперкомплексов дает ряд структурных и функциональных преимуществ, которые включают снижение производства реактивных видов кислорода, стабилизацию и более эффективную сборку отдельных респираторных цепных комплексов, регуляцию дыхательной цепной активности и профилактику агрегации белка в богатой белком среде внутренней мембраны. Изменения в сборке и составе суперкомплексов являются динамичными и все чаще лежат в основе изменений митохондриальной функции, наблюдаемых во время физиологической адаптации, а также различных генетических и приобретенных заболеваний.
Это видео представляет собой гибридный четкий / синий родной протокол PAGE для решения и анализа суперкомплексов в точной и своевременной основе. Основным преимуществом этого гибридного четкого/голубого родного метода PAGE является то, что он оптимально сочетает в себе различные аспекты традиционных синих и четких родных протоколов PAGE, что позволяет свести воздействие моющих средств и анионных соединений к минимуму по сравнению с опубликованными протоколами. Оптимальное разделение и анализ суперкомплексов достигается на больших градиентных гелях.
Эта процедура включает в себя несколько деликатных шагов, требующих ручных навыков и тщательного исполнения. Визуальная поддержка письменного протокола дает важные советы, которые облегчают реализацию метода. Демонстрация процедуры Александрия, аспирант из моей лаборатории.
Для начала центрифуга митохондрий изолирована от ткани животного в 1,5-миллилитровой трубке при 16 000 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Отбросьте супернатант и добавьте рассчитанный объем буфера извлечения ледяного холода, содержащего дигонин, в трубку для повторного перерасхода митохондриальных гранул. Поместите трубки на мини-трубчатый ротатор и инкубировать в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия со средней скоростью вращения.
Образцы центрифуги в 20, 400 раз-G в течение 45 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы удалить незолобилизированные фрагменты. Перенесите супернатант в новую трубку на льду. Если электрофорез не выполняется в тот же день, храните образцы при температуре минус 80 градусов по Цельсию.
Откройте литейную камеру. Поместите 20 сантиметров раз 22 сантиметров наружной стеклянной пластины в камеру. Распоить один набор 1,5-миллилитровых спейсеров с помощью карты выравнивания, чтобы убедиться, что они прочно сидят против боковых и углов камеры.
Поместите внутреннюю стеклянную пластину поверх проемов, чтобы сформировать гель бутерброд, и положить пластиковый лист разделения на верхней части стеклянной пластины. Упорядочить еще три геля сэндвич сборки. Добавить больше акриловых блоков или стеклянных пластин, если это необходимо, чтобы занять оставшееся пространство в камере.
Поместите полоску парафильма в паз, прежде чем стоять на прокладке твердо в прокладке. Поместите потолочную пластину на камеру и затяните все шесть винтов. Стенд литья камеры.
Поместите градиент бывший на тарелку перемешивания с магнитным мешалка в свет смешивания камеры. Подключите трубки литейной камеры к градиенту бывшего, и закрените трубки в кассете перистальтического насоса. Убедитесь, что стопкок градиента бывший закрыт.
Чтобы отлиты четыре геля, подготовить 60 миллилитров 4% и 60 миллилитров 12%gel растворов в двух колбы Erlenmeyer, и тщательно закружить, чтобы смешать. Налейте 4%gel раствор в камере смешивания света, и 12%в тяжелой камере резервуара градиента бывшего. Установите скорость перемешивания пластины при 350 об/мин.
Затем откройте стопкок и включите насос при 35 об/мин. После того, как уровень раствора световой фракции ниже, чем тяжелая фракция, приостановить насос и открыть клапан стебель между легкими и тяжелыми резервуарами. Пусть фракции объем equilibrate и перезапустить насос.
Убедитесь, что пузырьки не попадают в систему и попасть в ловушку между стеклянными пластинами. После того, как градиент гель полностью налил, остановить насос и наложить один миллилитр воды на каждый гель бутерброд для предотвращения высыхания геля. Пусть полимеризируется в течение двух часов.
Подготовка 25 миллилитров укладки геля в колбе Erlenmeyer и вихрь тщательно перемешать. Деликатно инвертировать монтаж, чтобы удалить воду, и вставить 15-хорошо гребни в каждом гель бутерброд. Налейте укладку геля и дайте ему полимеризировать в течение двух часов.
После этого вставьте гель и сэндвич зажимы и удалите гребень. С короткой стеклянной пластиной лицом вниз, вставьте гель бутерброд в охлаждающем ядре. Повторите на другой стороне и поместите ядро в бак электрофореза.
Налейте 300 миллилитров синего катодного буфера во внутреннюю камеру резервуара электрофореза. С пипеткой и погрузочными наконечниками загрузите от 75 до 175 микрограммов белка на колодец. В холодной комнате при четырех градусах Цельсия, подключите электроды к источнику питания и включите его до 150 вольт, и запустить гель в течение полутора часов, или до тех пор, пока образцы все вошли градиент гель.
Загрузка повторяет образец в отдельных скважинах, что позволяет параллельно определить активность в геле и иммуноблотный анализ комплексов OXPHOS. Удалите синий катодный буфер с пипеткой. Заменить 300 миллилитров Coomassie синий свободный буфер катода, и запустить гель на 200 вольт на ночь в холодной комнате.
Перед окончанием электрофорез, подготовить в гель буферов активности в соответствии с рукописью, и держать их в темноте при комнатной температуре. Остановите электрофорез и извлечения геля. Вырезать полиэтиленовый пакет, чтобы он может быть открыт, как книга.
Вырезать полосы движения и передачи гель полосы в полиэтиленовые пакеты. Используйте тепловой герметикер, чтобы запечатать две из трех сторон. Если проводятся эксперименты с отрицательным контролем, добавьте ингибиторы к буферам анализа.
Для трех экспериментальных образцов добавьте 20 миллилитров буфера активности в геле. Удалите пузырьки и запечатать четвертую сторону полиэтиленового пакета. Инкубировать гель полосы при 37 градусов по Цельсию в темноте и проверить каждые 15 минут.
Время инкубации варьируется в зависимости от количества белка и комплексов. После инкубации, промыть гель полос в воде, чтобы остановить реакцию, и изображение на белом фоне для комплекса I, сложный II, сложный IV, или черный фон для сложных V.For this example, комплекс IV в гель деятельности была выполнена для визуализации суперкомплексов изолированы от свежей мыши печени митохондрий. Оптимальное количество диготонина для этого образца составляет четыре грамма на грамм, так как обеспечивает хорошее разрешение мономерного комплекса IV и высокоядерных суперкомплексов.
При более низком соотношении полосы не ясны и решаются в мазок во время электрофореза, в то время как использование более высокого соотношения дигонина приводит к нарушению высокоядерных суперкомплексов веса. Митохондрии печени, изолированные от одной мыши, лечились оптимальным количеством дигитонина для извлечения респираторных суперкомплексов. Электрофоретическая подвижность комплексов OXPHOS немного снижается, когда белки отделяются с использованием гибридных четких/голубых родных условий PAGE, по сравнению со стандартным родным PAGE, из-за уменьшенного количества синего Кумасси.
Эта смена подвижности больше для сложных мономеров IV, за которыми следуют сложные мономеры V, и сложный I.The синий фон ниже в гибридном ясном родном/синем родном PAGE по сравнению с синим родным PAGE. Высокие фоновые уровни после синего родного PAGE полностью маскирует в гель деятельности окрашивания для комплекса II, и повышает фоновый шум, связанный с деятельностью сложных IV димеров. Для этого протокола, titration образцов интереса с различными количествами digitonin имеет решающее значение для того, чтобы определить условия, которые позволяют оптимальной solubilization, сохраняя при этом активность ферментов и физиологических белковых взаимодействий.
Все этапы, касающиеся литья геля, должны быть выполнены тщательно для формирования оптимального градиента для правильного разделения образца. Следует также принять крайнюю осторожность для манипуляции этими большими и хрупкими гелями. Всегда держите их с несколькими пальцами, используя высокий процент конца геля.
С помощью этого гибридного ясно / синий родной метод PAGE, образцы только подвергаются кратко анионический краситель Coomassie синий в начале электрофорез без воздействия каких-либо других моющих средств. Это позволяет отделить и решить суперкомплексы так же эффективно, как с традиционными синими родными методами PAGE, избегая при этом негативного влияния высоких уровней coomassie синий на в гель деятельности анализы и половых белково-белковых взаимодействий в суперкомплексах. Таким образом, с помощью этого протокола можно сочетать точные и быстрые измерения активности в геле с аналитическими методами, включающими 2D электрофорез, иммунодефицит и/или протеомический анализ суперкомплексов.
