Этот протокол важен, потому что он позволяет пользователям готовить образцы митохондрий из замороженных тканей, собранных из предыдущих исследований и архивированных. Этот протокол также уменьшает использование живых животных для сбора тканей. Этот метод позволяет пользователям использовать ранее замороженные архивные ткани для подготовки образцов, обогащенных митохондриями, используя мягкий метод измельчения тканей.
Этот метод приготовления максимизирует выход препарата митохондрий. Через чтение протокола рекомендуется обеспечить доступность всех компонентов и инструментов, особенно полностью заряженного привода шредера, а также упражнения с некоторыми нежелательными тканями, чтобы ознакомиться с шагами. Продемонстрировать процедуру будет Эдина Коса, научный сотрудник из моей лаборатории.
Для начала запишите вес трубки, содержащей сердечную ткань. Теперь взвесьте пустую трубку и вычтите ее из ранее зарегистрированного веса, чтобы получить чистый вес сердечной ткани. Поместите замороженную сердечную ткань непосредственно в стакан ледяного раствора.
Перемешивайте в течение пяти минут. Одновременно с помощью пинцета нанесите небольшое давление на ткани, чтобы вывести как можно больше крови. Выньте ткань щипцами и сожмите сердце чистым фильтрующим бумажным полотенцем, чтобы удалить кровь.
Затем поместите ткань в другой стакан ледяного раствора. После перемешивания ткани в течение пяти минут аккуратно высушите ткань на бумажном полотенце и удалите жир, свернувшуюся кровь, ушные раковины и фасции. Пул желудочковой ткани.
Чтобы измельчить образцы тканей, поместите от 50 до 300 миллиграммов сердечной ткани в камеру измельчителя тканей со стороны барана и закройте баранью сторону. Затем добавьте от 0,2 до 0,8 миллилитров промывочного буфера на сторону колпачка трубки. Используйте трубчатый инструмент, чтобы плотно закрыть камеру измельчителя крышкой измельчителя, не затягивая ее.
Поместите камеру измельчителя в держатель измельчителя тараном стороной вниз для включения фитинга. Вставьте и задействуйте биту полностью заряженного измельчителя с помощью колпачка измельчителя, обеспечивающего плотную фиксацию долота на месте, а затем подайте давление на водителя измельчителя в камере измельчителя до тех пор, пока индикатор давления на держателе измельчителя не достигнет значения примерно двух. Нажмите на спусковой крючок и запустите драйвер шредера в течение примерно 10-12 секунд, сохраняя настройку на уровне двух.
Наблюдайте за трубкой, чтобы обеспечить измельчение и прохождение всей или большей части тканевой массы через диск лизиса в верхнюю камеру измельчителя и при необходимости верните трубку держателю измельчителя для продолжения измельчения. После измельчения образца извлеките камеру измельчителя из держателя и используйте инструмент для трубки, чтобы снять крышку измельчителя и поместить ее на чистую поверхность для последующего использования, рекомендуется только в пределах того же образца, чтобы избежать перекрестного загрязнения от других образцов тканей. Переложите измельченную сердечную ткань в третий стакан с 40 миллилитрами промывочного буфера с перемешивающим батончиком и перемешайте ткань в течение пяти минут на средней скорости, находясь на перемешиваемой пластине.
Отфильтруйте суспензию через предварительно смачиваемую мононитью из нейлоновой сетки. После выбрасывания фильтрата промыть измельченную ткань на фильтр три раза 10 миллилитрами промывочного буфера. Переложите промытую ткань в 50-миллилитровый стакан с 20 миллилитрами промывочного буфера, помещенного в ледяную ванну на магнитном перемешивании.
Добавьте 0,5 миллилитра раствора трипсина, постоянно помешивая в течение 15 минут. Примерно на полпути через перемешивание перенесите суспензию ткани в свободно установленный ручной гомогенизатор из стекла на стекле, который может удерживать 15 миллилитров объема. Гомогенизируйте суспензию четырьмя-пятью мягкими ударами без образования пены.
Затем поместите гомогенат в 50-миллилитровый стакан и перемешайте на перемешивающей пластине. Далее добавляют 10 миллилитров изоляционного буфера, содержащего ингибитор трипсина, к гомогенату и инкубируют при осторожном перемешивании. После повторной фильтрации суспензии через нейлоновый фильтр сохраните фильтр в конической трубке объемом 50 миллилитров и перенесите фракцию твердых частиц, оставшуюся на фильтре, в гомогенизатор «стекло на стекле».
На 15-20 миллилитрах моющего буфера и аккуратно гомогенизируйте рукой в течение 25-30 секунд. После объединения гомогената с фильтратом и балансировки трубок центрифуга, а затем с помощью пластиковой пипетки удаляют супернатант, оставляя 0,2 миллилитра сверху пушистой гранулы. Отфильтруйте полученный супернатант в новую коническую трубку с помощью нейлонового фильтра, чтобы избежать загрязнения, и центрифугируйте еще раз.
После выброса супернатанта промыть гранулу два-три раза, добавив изоляционный буфер на боковую сторону трубки, чтобы предотвратить разрушение или загрязнение гранулы. Каждый раз отбрасывайте пушистый белый слой внешнего обода. Добавьте пять миллилитров изоляционного буфера в каждую трубку и разбейте гранулу с помощью пипетки с наконечником в один миллилитр или новой передаточной пипетки Затем разбавьте суспензию 20 миллилитрами дополнительного изоляционного буфера и центрифугируйте суспензию при 8, 500 X г в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия.
После выброса супернатанта повторно суспендируют гранулу сначала в пяти миллилитрах, а затем в дополнительных 15 миллилитрах буфера повторного использования и центрифуги при 8 500 Х г в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Теперь отбросьте супернатант и сохраните коричневую гранулу, содержащую вымытые неповрежденные митохондрии. Повторное суспендирование обогащенной митохондриями гранулы в 250 микролитрах повторного буфера, включая ингибиторы протеазы.
Aliquot суспензия объемом 25 микролитров, быстро замораживается в жидком азоте и хранится в морозильной камере с температурой 80 градусов Цельсия в течение нескольких лет. Следуя протоколу, обогащенный митохондриями белок был получен из сердца потомства, рожденного двумя группами свиноматок. Один из них тренировался во время беременности, а другой вел сидячий образ жизни.
Анализ белкового профиля ETC показал, что потомство тренирующихся свиноматок представляло относительно сниженные уровни в некоторых комплексах ETC. Митохондриальные белки были разрешены в 3-8% градиенте BN-PAGE и иммунопробированы коктейлями антител. Как физические, так и сидячие группы демонстрируют множественные суперкомплексы.
Заметное суперкомплексное увеличение наблюдалось через девять месяцев в группе упражнений по сравнению с сидячей группой. Обогащенные митохондриями белки, полученные из разных возрастных групп 48 часов три месяца, шесть месяцев и девять месяцев, были проанализированы на комплексную активность I-II с использованием кинетического анализа. Тренируемая группа показала комплексную активность I-II по сравнению с сидячей группой.
Целесообразность функциональных исследований митохондрий, полученных из замороженных тканей и клеток, показана другими исследователями. Препарат митохондрий, полученный из замороженной ткани, может применяться для самых разнообразных тканей с минимальным повреждением.
