Основная цель в биологии развития заключается в том, чтобы понять контекстную роль гена. И этого может быть трудно достичь обычными нокаут-мутантами или составными линиями переэкспрессии. Мы использовали модульную систему клонирования зеленых ворот для создания ресурса для неиссякаемого цитоспецифического выражения в трех основных меристемах модельного растения Arabidopsis thaliana.
Используя ту же модульную стратегию клонирования, этот метод может быть применен к другим видам растений, которые неизменяемы для трансформации. Визуальная демонстрация этой процедуры ценна, потому что анализ эффекта трансактивации в меристемах стебля и короткой вершине требует вскрытия перед визуализацией, что может быть довольно сложной задачей. Для начала стерилизовать семена, как указано в текстовом протоколе.
Далее, подготовить половину силы Murashige и Skoog среды на рН 5,8 и добавить один процент сахарозы и 0,9%agar. После автоклавирования добавьте Декс, растворенный в DMSO, в индукционные пластины в конечной концентрации от 10 до 30 микромолеров. Добавьте равное количество DMSO к контрольным пластинам.
Положите семена для корневой визуализации на пластины и расслоить их в течение 48 часов в темноте и при четырех градусах по Цельсию. Поместите пластины в вертикальное положение в инкубатор растений и выращивайте их в течение пяти дней. Через пять дней после прорастания используйте конфокальные лазерные сканирующие микроскопии для изображения саженцев.
Для начала подготовьте и вырастите семена, изложенные в текстовом протоколе. Через шесть-семь дней после прорастания перенесите каждого саженца на почву в отдельном горшке. При индуцировании растений путем полива, используйте 25 микромоляных раствор DEX в воде, приготовленные из бульона 25 миллимоляров DEX растворяется в этаноле.
Вода каждые два-три дня до желаемого времени индукции. При индуцировании путем погружения, подготовить один литр стакана с 750 миллилитров воды, содержащей 0,02%Silwet L77 и DEX на 25 микромолярной конечной концентрации или эквивалентное количество DMSO для DEX и макет лечения. Опустите одно растение в индукционный или макет раствора в течение 30 секунд.
Повторяйте каждые два-три дня, до желаемого времени визуализации. Для начала подготовьте и вырастите семена, изложенные в текстовом протоколе. Через шесть-семь дней после прорастания перенесите каждого саженца на почву в отдельном горшке.
Когда стебель составляет около одного сантиметра в длину, спрей influorescent SAM с между 10 и 50 микромоляных DEX раствор в воде. Для индукции и визуализации на более поздних стадиях развития индуцировать SAMs более длинных стеблей или боковых побегов. Через 24-48 часов после индукции, вскрыть SAMs и приступить к визуализации.
Во-первых, перенесите саженцы с тарелки на 10 микрограмм на миллилетный раствор йодида пропидия и пристегните их в течение пяти минут. Поместите корни в камеру визуализации микроскопа и изведайте их с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа с целью 63-х погружений в воду. Чтобы визуализировать флуоресценцию пропидия йодида, используйте возбудительную длину волны 488 нанометров и соберите выбросы между 590 и 660 нанометров.
Для флуоресценции mTurquoise2 используйте 458 нанометров и собирайте выбросы между 460 и 615 нанометров с помощью последовательного сканирования. Во-первых, исправить стебель пальцем на противоположной стороне желаемого раздела. Используя лезвие бритвы, вырежьте сегмент примерно на три сантиметра и выполните несколько тонких разрезов.
Промыть лезвие бритвы в чашке Петри, содержащей водопроводную воду и собирать стволовые секции. Либо пятно разделов или непосредственно смонтировать их на микроскоп слайды. Для окрашивания приготовьте один миллилитр 250 микрограмм на миллилитр раствора йодида пропидия в реакционной трубке.
Удалить водопроводную воду из чашки Петри с пипеткой и заменить его раствором йодида пропидия и пятно в течение пяти минут. Затем удалите раствор йодида пропидия и промойте водой. Используя либо тонкие типсы, либо тонкую кисть, перенесите окрашенные секции на микроскопные слайды.
Используйте конфокальный лазерный сканирующий микроскоп с 25-м объективом погружения в воду для изображения образцов. Используйте лазерный свет 561 нанометров для возбуждения флуоресценции йодида пропидия и сбора выбросов от 570 до 620 нанометров. Используйте 405 нанометровый лазерный свет, чтобы возбудить флюорофорный эффектор mTurquoise2, закодированный конструкцией линии драйвера, и собрать выбросы от 425 до 475 нанометров.
Во-первых, используйте типсы, чтобы сократить стебель на два сантиметра ниже наконечника съемки. Держите стебель в одной руке и использовать тонкие типсы, чтобы удалить цветочные почки и большие primordia. Чтобы удалить молодую имордию, зафиксните SAM в вертикальном положении в чашке Петри, содержащей трехпроцентную агарозу.
Далее, используйте бинокль и типсы, чтобы удалить любые молодые primordia близко к SAM. Перенесите вскрытый SAM в трубку, содержащую 250 микрограмм на миллилитр раствора йодида пропидия. Пусть образец пятно в течение пяти до 10 минут, убедившись, что образец остается полностью погружен во время процедуры окрашивания.
Поместите окрашенные SAM в небольшой чашки Петри, содержащие три процента агарозы среды. Обложка SAM с двойной дистиллированной водой. Используйте конфокальный лазерный сканирующий микроскоп, оснащенный 25-м объективом погружения в воду для изображения вскрытых SAMs.
Используйте 561 нанометровый лазерный свет для возбуждения флуоресценции йодида пропидия и сбора выбросов от 570 до 620 нанометров. Используйте 405 нанометровый лазерный свет, чтобы возбудить флюорофор mTurquoise2 и собрать выбросы от 425 до 475 нанометров. Рекордные стеки изображений, охватывающие 50 микрометров в направлении q с размером шага 0,5 микрометра.
Индукция с DEX приводит к клеточного типа конкретных mTurquoise2 выражение в корневой эндодермии флоэм прекурсоров и камбия, и стволовые клетки в стрелять апический меристем. В качестве тестового случая для трансактивации генерируется линия эффектора, кодирующей вторичный фактор транскрипции стенок ячейки VND7, слитый с доменом активации V16. После пяти дней разового лечения либо с 15 микролитров DEX или DMSO, стволовые секции готовятся для визуализации эктопической иньификации в начале оболочки.
Стартовые клетки оболочки в индуцированных образцах показывают сильный сигнал для канала йодида пропидия, и некоторые клетки показывают типичное утолщение стенки клетки в клетках ксилема. После просмотра этого видео, вы должны иметь четкое понимание того, как вызвать экспрессию генов в различных тканях и как подготовить образцы для визуализации. После этой процедуры установленные линии драйверов могут использоваться с широким спектром конструкций эффекторов, генерируемых другими пользователями в соответствии с их исследовательскими интересами.
Этот ярлык должен помочь исследователям завода быстро оценить влияние клеточного типа специфического выражения или нокдауна гена интереса в зарезервированном временем образе. Эта специфическая индукционная система клеточного типа требует использования кортикостероидного дексаметазона. Прямого контакта следует избегать, поэтому важно носить перчатки и маску для лица во время лечения.
