המטרה העיקרית בביולוגיה התפתחותית היא להבין את התפקיד הספציפי להקשר של גן. וזה יכול להיות קשה להשיג על ידי מוטנטים נוקאאוט קונבנציונליים או על ידי קווי דיכוי יתר מכוננים. השתמשנו במערכת שיבוט השערים הירוקים המודולרית כדי ליצור משאב לביטוי ספציפי לציטו בלתי ניתן לעיכול בשלושת המריסתמים העיקריים של מפעל המודל Arabidopsis thaliana.
באמצעות אותה אסטרטגיית שיבוט מודולרית, ניתן ליישם שיטה זו על מיני צמחים אחרים שלא ניתן לשנותם. הדגמה חזותית של הליך זה היא בעלת ערך משום שניתוח ההשפעה של הפעלה טרנס-הפעלה ב meristems של הגבעול ואת apex קצר דורש ניתוח לפני הדמיה, אשר יכול להיות מאתגר למדי. כדי להתחיל, לעקר את הזרעים כמפורט בפרוטוקול הטקסט.
לאחר מכן, הכינו את מוראשיג' וסקוק בינוניים בחצי העוצמה ב-pH 5.8 והוסיפו אחוז סוכרוז אחד ו-0.9% אגר. לאחר autoclaving, להוסיף Dex מומס DMSO לצלחות אינדוקציה בריכוז הסופי בין 10 ל 30 מיקרומולר. הוסף כמות שווה של DMSO לוחות הבקרה.
שים את הזרעים עבור הדמיה שורש על צלחות לשכבות אותם במשך 48 שעות בחושך בארבע מעלות צלזיוס. שים את הצלחות במצב אנכי באינקובטור צמחים ולגדל אותם במשך חמישה ימים. חמישה ימים לאחר הנביטה, השתמש במיקרוסקופיה של סריקת לייזר קונפוקלי כדי לדמיין את השתילים.
כדי להתחיל, להכין ולגדל את הזרעים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. שישה עד שבעה ימים לאחר הנביטה, מעבירים כל שתיל לאדמה בסיר נפרד. אם גרימת הצמחים על ידי השקיה, להשתמש בתמיסת DEX 25 micromolar במים, מוכן מתוך מלאי של 25 מילימולר DEX מומס באתנול.
מים כל יומיים עד שלושה ימים עד לזמן הרצוי של אינדוקציה. אם גרימת על ידי טבילה, להכין מקור של ליטר אחד עם 750 מיליליטר של מים המכילים 0.02%Silwet L77 ו DEX ב 25 מיקרומולרית ריכוז סופי או כמות שוות ערך של DMSO עבור DEX וטיפול מדומה. טובלים צמח אחד לתוך אינדוקציה או פתרון מדומה במשך 30 שניות.
יש לחזור על הפעולה כל יומיים-שלושה, עד לזמן הרצוי של ההדמיה. כדי להתחיל, להכין ולגדל את הזרעים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. שישה עד שבעה ימים לאחר הנביטה, מעבירים כל שתיל לאדמה בסיר נפרד.
כאשר הגבעול הוא סביב סנטימטר אחד ארוך, לרסס את SAM שפעת עם בין 10 ל 50 פתרון DEX micromolar במים. עבור אינדוקציה והדמיה בשלבים מאוחרים יותר של הפיתוח, לגרום SAMs של גבעולים ארוכים יותר או יורה בצד. 24 עד 48 שעות לאחר הגיוס, לנתח את SAMs ולהמשיך הדמיה.
ראשית, להעביר את השתילים מהצלחת לתו 10 מיקרוגרם למיליליטר של פרופידיום יודיד ונגד אותם במשך חמש דקות. מניחים את השורשים בתא הדמיה מיקרוסקופ ולדמיין אותם באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקל עם מטרה טבילה במים 63x. כדי לדמיין פרופידיום יודיד פלואורסצנטיות, להשתמש באורך גל של 488 ננומטר ולאסוף פליטה בין 590 ל 660 ננומטר.
עבור פלואורסצנטיות mTurquoise2, יש להשתמש ב-458 ננומטר ולאיסוף פליטה בין 460 ל-615 ננומטר באמצעות סריקה רציפה. ראשית, לתקן גבעול עם אצבע בצד הנגדי של החלק הרצוי. בעזרת סכין גילוח, חותכים מקטע של כשלושה סנטימטרים ומבצעים מספר חתכים עדינים.
שוטפים את סכין הגילוח בצלחת פטרי המכילה מי ברז ואוסף את חלקי הגזע. או להכתים את החלקים או ישירות לטעון אותם על שקופיות מיקרוסקופ. עבור כתמים, להכין מיליליטר אחד של 250 מיקרוגרם לכל פתרון מיליליטר של פרופידיום יודיד בצינור תגובה.
מוציאים את מי הברז מצלחת פטרי עם פיפטה ומחליפים אותה בתסכת הפרופידיום יודיד וכתם במשך חמש דקות. לאחר מכן, להסיר את פתרון יודיד פרופיד ולשטוף עם מים. באמצעות מדפים עדין או מברשת צבע עדין, להעביר את החלקים מוכתמים שקופיות מיקרוסקופ.
השתמש במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקל עם עדשת טבילת מים טבילה 25x כדי לדמיין את הדגימות. השתמש באור לייזר 561 ננומטר כדי לרגש פרופידיום יודיד פלואורסצנטי ולאסוף פליטה מ 570 כדי 620 ננומטר. השתמש באור לייזר 405 ננומטר כדי לרגש את אפקט הפלואורופור mTurquoise2 המקודד על ידי מבני קו הנהג ולאסוף פליטה מ 425 עד 475 ננומטר.
ראשית, השתמש במדפים כדי לחתוך את הגבעול שני סנטימטרים מתחת לקצה לירות. החזק את הגבעול ביד אחת ולהשתמש מטלפים עדין כדי להסיר את ניצני הפרחים פרימורדיה גדולה. כדי להסיר פרימומדיה צעירה, לתקן את SAM במצב זקוף בצלחת פטרי המכיל שלושה אחוזים agarose.
לאחר מכן, השתמש במשקפת ומדפים כדי להסיר כל פרימורדיה צעירה קרוב SAM. העבר את SAM נותחה לצינור המכיל 250 מיקרוגרם לכל פתרון מיליליטר של פרופידיום יודיד. תן לכתם המדגם במשך חמש עד 10 דקות תוך הקפדה על הדגימה נשארת שקועה לחלוטין במהלך הליך הכתם.
מניחים את SAM מוכתם לתוך צלחת פטרי קטנה המכילה שלושה אחוזים אגרוז בינוני. כסו את ה-SAM במים מזוקקים כפולים. השתמש במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי המצויד בעדשת טבילת מים טבילה 25x כדי לדמיין את ה- SAMs שנותקו.
השתמש באור לייזר 561 ננומטר כדי לרגש פרופידיום יודיד פלואורסצנטי ולאסוף פליטות מ 570 כדי 620 ננומטר. השתמש באור לייזר 405 ננומטר כדי לרגש את הפלואורופור mTurquoise2 ולאסוף פליטה מ 425 עד 475 ננומטר. רשום ערימות תמונה המשתרעות על פני 50 מיקרומטר בכיוון Z בגודל צעד של 0.5 מיקרומטר.
אינדוקציה עם DEX מובילה לביטוי mTurquoise2 ספציפי לסוג התא בביטוי השורש אנדודרמיס מבשרי פלואם וקמביום, ותאי הגזע ב- meristem apical לירות. כמקרה בדיקה עבור טרנסאקטיביות, נוצר קו אפקט המקודד את גורם התמלול הראשי של קיר התא המשני VND7 לתחום ההפעלה V16. לאחר חמישה ימים של טיפול יחיד עם 15 microliters של DEX או DMSO, קטעי גזע מוכנים להדמיה של lignification חוץ רחמי במסלקת ההתחלה.
תאי הנדן הקדומים בדגימות המושרות מראים אות חזק לערוץ ה-propidium iodide, ותאים מסוימים מראים את עיבוי המרסן הטיפוסי של קיר התא בתאי קסים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה ברורה של איך לגרום ביטוי גנים ברקמות שונות וכיצד להכין את הדגימות שלך להדמיה. בעקבות הליך זה, קווי הנהג הוקמה ניתן להשתמש עם מגוון רחב של מבנים משפיעים שנוצרו על ידי משתמשים אחרים על פי האינטרסים המחקר שלהם.
קיצור דרך זה אמור לעזור לחוקרי הצמח להעריך במהירות את ההשפעה של ביטוי ספציפי לסוג התא או הפלה של גן מעניין בזמן שמורות. מערכת אינדוקציה ספציפית זו של סוג התא דורשת שימוש ב- dexamethasone קורטיקוסטרואידים. יש להימנע ממגע ישיר, ולכן חשוב ללבוש כפפות ומסכת פנים במהלך הטיפול.
