Этот протокол может быть использован для решения важных вопросов в фундаментальных и клинических исследованиях, глядя на экспрессию белка в различных тканях и точках времени. Для выполнения надежных количественных западных blotting, мы объединяем флуоресцентные общее пятно белка с внутренним контролем загрузки. Это преодолевает ограничения, возникающие при сравнении различных тканей в экспериментальных условиях.
Для извлечения белков из проб замороженных клеток или тканей, оттепель минус 80 градусов образцов на льду перед мытьем образцов по мере необходимости, в соответствии с таблицей. Используя портативный электрический гомогенизатор с полипропиленовым пестиком, гомогенизируйте промытые образцы, полоская пестик в двухгодостильной воде и высыхая чистой тканью между образцами. Оставьте образцы на льду на 10 минут, после чего последует центрифугация.
Затем перенесите белково-образный супернатант в новую трубку на льду, не нарушая гранулы. Для количественной оценки концентрации белка, создать бычьей сыворотки альбумин стандартов при увеличении концентраций в тройной, и добавить один микролитр каждого образца белка в дубликат соответствующих скважин 96-ну оптической пластины. Инкубировать белок на 60-градусный по Цельсию тепловой блок в течение 10 минут или дольше, если концентрация белка, как ожидается, будет низкой и измерить поглощение на 560 нанометров на пластине читателя.
Экспорт считыватель пластин измерений и рассчитать концентрацию белка, сравнивая средние значения абсорбтирования каждого образца стандартной кривой, полученной с использованием белкового стандарта. Чтобы нормализовать количество белка, приготовьте разбавления образцов белка в буфере образца и ультра-чистой воде и инкубировать образцы в тепловом блоке 70 градусов по Цельсию в течение 10 минут. Затем поместите образцы на лед перед вихрем и кратко центрифугой.
Для электрофорез, создать precast от четырех до 12%Bis-Tris градиент гель в гель электрофорез камеры системы и нагрузки 3,5 микролитров белка стандарта в колодец. При использовании внутреннего стандарта для нормализации между мембранами загрузите количество, равное другим образцам, в первые три скважины рядом с белковой лестницей и загрузите 30 микрограммов каждого образца в оставшиеся скважины. Затем запустите образцы через укладку геля на 80 вольт в течение 10 минут, а затем 150 вольт в течение дополнительных 45 до 60 минут.
В конце электрофореза, чтобы собрать стек передачи, поместите белковый гель на нижний стек, содержащий мембрану дифторида поливинилин, а затем фильтровальную бумагу. Используйте ролик для удаления пузырьков воздуха и поместите верхний стек в верхней части фильтровальной бумаги перед прокаткой стека снова, чтобы удалить пузырьки воздуха. Перенесите весь стек в устройство передачи с электродом на левой стороне устройства и поместите губку геля поверх стека так, чтобы губка выровнялась с соответствующими электрическими контактами на устройстве.
После закрытия крышки выберите и запустите соответствующую программу. В конце программы, сократить мембрану до размера геля и мыть вырезать мембраны быстро с двойной дистиллированной воды, прежде чем продолжить с общим пятном белка. Для полного окрашивания белка, свернуть мембрану в 50-миллилитровую трубку с белковой стороны, обращенной внутрь и этикетки мембраны с пятью миллилитров белкового раствора пятна на ролике в течение пяти минут при комнатной температуре в дымовой капот.
В конце инкубации, мыть мембрану быстро с пятью миллилитров раствора для мытья, возвращая трубку кратко ролик между моет, а затем краткое полоскание с ультра-чистой водой. Добавьте три миллилитров блокирующего буфера в мембрану и верните мембрану в ролик на 30 минут при комнатной температуре. Замените блокирующий буфер первичным антителом интереса при соответствующей оптимизированной концентрации и инкубировать мембрану на ролике на ночь при четырех градусах по Цельсию.
На следующий день, мыть мембрану шесть раз в течение пяти минут с пятью миллилитров свежих PBS на мытье на ролике при комнатной температуре. После последней стирки инкубировать мембрану соответствующим вторичным раствором антитела на ролике в течение одного часа при комнатной температуре с последующим тремя мойки в течение 30 минут за стирку. После последней стирки высушите мембрану и используйте алюминиевую фольгу, чтобы мембрана была защищена от света.
Для получения изображения поместите мембрану на сканер с белковой стороной лицом вниз и выберите область сканирования в программном обеспечении. Затем приобретайте изображения в обоих каналах и экспортуйте изображения в соответствующую программу анализа изображений. Отобразить 700-нанометровый канал, чтобы показать общий результат окрашивания белка и выбрать анализ и нарисовать прямоугольник, чтобы определить область интереса для нормализации.
Затем скопируйте и вставьте первую прямоугольную область на каждый отдельный образец, чтобы обеспечить одинаковый размер определенной области для всех проанализированных полос движения. Для количественной оценки концентрации белка в каждой полосе, скопировать результаты как от общего пятна белка и белка, представляющих интерес для электронной таблицы программы и определить самый высокий общий сигнал пятна белка. Затем разделите общее значение сигнала пятна протеина этим значением для того чтобы получить нормализованное значение нагрузки протеина и разделить значение сигнала 800-нанометров от каждого отдельно образца своим соотве значением нормализованного протеина для того чтобы высчитать относительное отношение выражения протеина в по-разному образцах.
В этих репрезентативных западных помарках, протеины извлеченные от тканей полученных от post-natal мышей дня 5 сравнены к протеинам извлеченным от 10-недельных взрослых мышей. Количественная оценка интенсивности флуоресценции общего белкового пятна была достигнута путем измерения интенсивности флуоресценции внутри прямоугольной коробки на каждой полосе. При анализе целых полос интенсивность флуоресценции остается относительно аналогичной в разных образцах, что указывает на то, что для этой цели подходит использование общего белкового пятна для нормализации.
Флуоресцентное общее пятно белка также может быть использовано для сравнения уровня белка в различных точках времени развития. Например, хотя уровень белка моторных нейронов выживания явно снижается с возрастом у мышей, общая количественная количественная количественная оценка белка остается постоянной. Использование внутренних стандартов, нормализация на основе флуоресценции и адекватная статистика повышают надежность комплексного анализа экспрессии белка в различных условиях.
Этот протокол дополняет традиционные западные методы помарки, преодолевая вопросы соответствующего контроля загрузки и сравнения между экспериментальными партиями, а также обеспечивая гибкость для анализа экспрессии белка. Этот подход может быть распространен на сравнение экспрессии белка в других экспериментальных условиях.
