이 프로토콜은 다른 조직 및 시간 점에 걸쳐 단백질 발현을 보고 근본적인 임상 연구에서 중요한 질문을 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 신뢰할 수 있는 정량적 서양 얼룩을 수행하기 위해 형광 총 단백질 얼룩과 내부 적재 제어를 결합합니다. 이것은 실험 조건에 걸쳐 각종 조직을 비교할 때 생기는 한계를 극복합니다.
스냅 냉동 세포 또는 조직 샘플에서 단백질을 추출하려면 표에 따라 샘플을 적절하게 세척하기 전에 얼음에 마이너스-80도 샘플을 해동하십시오. 폴리프로필렌 유봉이 있는 핸드헬드 전기 균질화제를 사용하여 세척된 샘플을 균질화하고, 이중 증류수로 유봉을 헹구고, 샘플 사이에 깨끗한 조직으로 건조시. 샘플을 얼음 위에 10분 간 두고 원심분리가 뒤따릅니다.
그런 다음, 펠릿을 방해하지 않고 얼음에 새로운 튜브에 단백질 샘플 함유 슈퍼상체를 전송. 단백질 농도의 정량화를 위해, 트리플리케이트의 농도증가에 소 혈청 알부민 기준을 설정하고, 각 단백질 샘플의 마이크로리터 1개를 96웰 광학 플레이트의 적절한 우물에 중복하여 첨가한다. 단백질 농도가 낮을 것으로 예상되는 경우 60도 섭씨 열 블록에 단백질을 10분 이상 배양하고 플레이트 판독기에서 560 나노미터에서 흡수를 측정합니다.
플레이트 판독기 측정을 내보내고 각 샘플의 평균 흡광도 값을 단백질 표준을 사용하여 얻은 표준 곡선과 비교하여 단백질 농도를 계산합니다. 단백질의 양을 정상화하기 위해, 샘플 버퍼및 초순수수에서 단백질 샘플의 희석을 준비하고 10분 동안 70도 섭씨 열 블록에서 시료를 배양한다. 그런 다음 샘플을 얼음 위에 놓고 소용돌이를 가하고 잠시 원심분리합니다.
전기 포거의 경우, 젤 전기 전광 챔버 시스템에 4 ~ 12 %의 비스 트리스 그라데이션 젤을 설정하고 단백질 표준의 3.5 마이크로 리터를 우물에 로드합니다. 멤브레인 정상화를 위해 내부 표준을 사용하는 경우 단백질 사다리 옆에 있는 처음 세 개의 우물에 다른 샘플과 동일한 양을 적재하고 각 샘플의 30 마이크로그램을 나머지 우물에 적재합니다. 이어서, 스태킹 젤을 통해 샘플을 10분 동안 80볼트로 실행하고 45~60분 동안 150볼트를 추가로 실행한다.
전기포광의 끝에서, 전달 스택을 조립하기 위해, 단백질 젤을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인을 포함하는 바닥 스택에 놓는 다음 필터 종이를 한다. 블로팅 롤러를 사용하여 기포를 제거하고 필터 용지 상단에 상단 스택을 놓은 다음 스택을 다시 롤링하여 기포를 제거합니다. 장치의 왼쪽에 전극을 가진 전체 스택을 전달 장치로 옮기고 스폰지가 장치의 해당 전기 접촉과 정렬되도록 스택 위에 젤 스폰지를 놓습니다.
뚜껑을 닫은 후 적절한 프로그램을 선택하고 시작합니다. 프로그램이 끝나면 멤브레인을 젤 크기로 자르고 절단 막을 이중 증류수로 신속하게 세척한 후 총 단백질 얼룩을 계속 합니다. 총 단백질 염색을 위해, 단백질 측이 안쪽을 향하고 있는 50 밀리리터 튜브로 막을 굴려 연기 후드의 실온에서 5 분 동안 롤러에 단백질 얼룩 용액의 5 밀리리터로 막을 라벨.
인큐베이션이 끝나면 5밀리리터의 워시 용액으로 멤브레인을 신속하게 세척하고 튜브를 세척 사이에 롤러로 간단히 되돌리고 초순수물로 짧은 헹구는 것입니다. 멤브레인에 블로킹 버퍼 3밀리리터를 추가하고 실온에서 30분 동안 멤브레인을 롤러로 되돌려 보입니다. 블로킹 버퍼를 적절한 최적화된 농도에서 관심 있는 1차 항체로 교체하고 밤새 4도에서 롤러의 멤브레인을 배양한다.
다음 날, 실온에서 롤러에 신선한 PBS의 5 밀리리터와 5 분 동안 멤브레인을 6 번 세척합니다. 마지막 세척 후, 실온에서 1 시간 동안 롤러에 적절한 이차 항체 용액으로 멤브레인을 인큐베이션한 다음 세척당 30 분 동안 3 개의 세척을 합니다. 마지막 세척 후 멤브레인을 건조하고 알루미늄 호일을 사용하여 멤브레인을 빛으로부터 보호합니다.
이미지 수집을 위해 단백질 측이 아래로 향하여 스캐너에 멤브레인을 배치하고 소프트웨어의 스캔 영역을 선택합니다. 그런 다음 두 채널모두에서 이미지를 획득하고 이미지를 적절한 이미지 분석 프로그램으로 내보냅니다. 700나노미터 채널을 표시하여 총 단백질 염색 결과를 표시하고 해석 및 그리기 사각형을 선택하여 정상화에 대한 관심 영역을 정의합니다.
그런 다음 정의된 영역이 분석된 모든 레인에 대해 동일한 크기인지 확인하기 위해 첫 번째 사각형 영역을 각 개별 샘플에 복사하여 붙여 넣습니다. 각 차선의 단백질 농도를 정량화하기 위해 총 단백질 얼룩과 관심 있는 단백질모두에서 결과를 스프레드시트 프로그램에 복사하고 가장 높은 총 단백질 얼룩 신호를 결정합니다. 이어서, 각 총 단백질 얼룩 신호 값을 이 값별로 나누어 정규화된 단백질 적재값을 얻고 각 개별 샘플로부터 800나노미터 신호 값을 상응하는 정규화된 단백질 값으로 나누어 상이한 시료에서 상대단백질 발현비를 계산한다.
이러한 대표적인 서양 얼룩에서, 산후 5마리의 마우스로부터 얻은 조직에서 추출된 단백질은 10주된 성인 마우스에서 추출한 단백질과 비교된다. 총 단백질 얼룩의 형광 강도의 정량화는 각 차선의 사각형 상자 내부의 형광 강도를 측정함으로써 달성되었다. 전체 차선을 분석할 때, 형광 강도는 시료 전반에 걸쳐 상대적으로 유사하게 유지되며, 이는 정규화를 위해 총 단백질 얼룩을 사용하는 것이 이러한 목적에 적합하다는 것을 나타냅니다.
형광 총 단백질 얼룩은 또한 다른 발달 시간 지점에서 단백질 수준을 비교하기 위하여 이용될 수 있습니다. 예를 들어, 생존 운동 뉴런 단백질 수치가 마우스의 나이에 따라 명확하게 감소하지만, 총 단백질 염색 정량화는 일정하게 유지됩니다. 내부 표준, 형광 기반 정규화 및 적절한 통계를 사용하면 다양한 조건에서 복잡한 단백질 발현 분석의 견고성을 증가시킵니다.
이 프로토콜은 전통적인 서양 얼룩 기술에 추가, 실험 배치에 걸쳐 적절한 로딩 제어 및 비교의 문제를 극복하고, 단백질 발현 분석을위한 유연성을 제공. 이 접근법은 그밖 실험 조건의 밑에 단백질 발현을 비교하기 위하여 확장될 수 있습니다.
