Используя этот протокол, оксид дейтерия, или D2O, нерадиоактивный, стабильный изотоп воды, может быть использован для оценки состава тела и потребления воды. Этот метод неинвазивный и поэтому может быть использован для оценки состава тела у исчезающих видов, а также у людей и домашних видов. Уникальным применением метода разбавления оксида дейтерия является способность измерять потребление воды свободной дикой природы с высокими показателями захвата или социально проживающих животных.
Хотя анестезия не требуется, это может быть проще для тех, кто не знаком с предоставлением подкожных инъекций, чтобы усылать животных перед доставкой оксида дейтерия. Демонстрация процедуры с Сарой Хупер и мной будет Аманда Эшельман и Эшли Коуэн, ветеринарные студенты, и Алисия Roistacher, аспирант из моей лаборатории. Чтобы сделать 50-миллилитровый раствор бульона из девяти граммов на литр соленого оксида дейтерия, сначала весят 450 миллиграммов хлорида натрия фармацевтического класса и записывают точное количество до четырех десятичных мест.
Перенесите всю соль в стерилизованный 100-миллилитровый стакан и измерьте 50 граммов больше или равна 99,8%оксида дейтерия в стерильном цилиндре. Завехайте точное количество оксида дейтерия в четырех десятичных местах и перенесите оксид дейтерия в стерильный стакан хлорида натрия. Затем прикрепите иглу 20-го калибра к непирогеническому стерильному дисковому фильтру с субмихронными порами, оснащенными 10-миллилитровым шприцем, и вставьте иглу в перегородку стерильного, пустого 100-миллилитрового флакона.
Прикрепите вакуумную трубку к игле 22-го калибра и вставьте иглу в перегородку 100-миллилитрового флакона. Затем загрузите 10 миллилитров изосмотической прочности хлорида натрия в бочку шприца и медленно включите вакуум до тех пор, пока раствор оксида дейтерия не начнет медленно фильтроваться во флакон. Продолжайте заливки раствора бульона оксида дейтерия в бочку шприца до тех пор, пока весь 50-миллилитровый объем не будет отфильтрован.
После подтверждения отсутствия реакции на щепотку носа в анестезируемой летучей мыши, используйте алкоголь подготовки площадку для очистки uropatagium над межфеморальной вены, и позволяют дезинфицировать хвостовой мембраны высохнуть. Нанесите тонкий слой вазелина на межфеморную вену и используйте 29-калибровочных игл для прокола спинной части межфеморальной вены. Затем используйте пластиковые капиллярные трубки натрия для сбора 100 микролитров крови.
Для обеспечения адекватного смешивания всей крови с гепарином натрия, аккуратно свернуть каждую трубку после сбора крови перед маркировкой. После определения массы оксида дейтерия в граммах для инъекций загрузите инсулиновый шприц, оснащенный иглой 29-го калибра с соответствующим объемом оксида дейтерия. Взвесить дейтерия загруженных инсулина шприц и иглы, запись веса до четырех десятичных мест, и вводить весь объем оксида дейтерия подкожно над спинной области бедра обезболивающей летучей мыши.
Мы рекомендуем использовать точную шкалу с антистатическим щитом проекта и убедиться, что отступить на поршень для обеспечения отрицательного давления до инъекций. Сразу после инъекции взвесь пустой инсулиновый шприц и иглу и зафиксировать вес до четырех десятичных мест. В течение 30 минут после сбора крови используйте центрифугу гематокрита, чтобы вращаться вниз по каждой капиллярной трубке при 10 000 раз г в течение пяти минут.
Используя острые ножницы, вырезать пластиковую капиллярную трубку между всей кровью и плазмой, и использовать 200-микролитровый пипетку, чтобы изгнать плазму непосредственно в помечены, 500-микролитер трубки хранения. После периода эквилибрации соберите и храните еще 100 микролитров крови из межфеморальной вены, как только что продемонстрировано. Для анализа спектрофотометрии FTIR установите температуру песчаной ванны до 60 градусов по Цельсию, чтобы облегчить дистилляцию, и добавьте 50 микролитров каждого образца плазмы и стандарт в отдельные 1,5-миллилитровые конические микроцентрифуги колпачки.
Ведение микроцентрифуг крышка вверх дном, винт 1,5-миллилитровый конической микроцентрифуг трубки на крышку, и место перевернутой трубки в контакте с песком в песчаной ванне в течение как минимум 12 часов. На следующее утро поместите новую чистую крышку на каждую трубку и пульсировать микроцентрифугные трубки в течение 10 секунд в микроцентрифуге. Установите ячейку жидкой трансмиссии в спектрометр FTIR и заполните клетку метанолом.
Подключите инъекционный порт и медленно заполните клетку фоновой водой, тщательно удалив шприц метанола, чтобы снизить риск пузырьков воздуха. Прикрепите трубки к выходной порт, чтобы разрешить удаление образцов после анализа, и откройте программное обеспечение спектрометра FTIR. Установите параметры в соответствии с таблицей и соберите фоновый образец с помощью разминочных, 0,22-микрометра фильтруемой дистиллированной воды.
Ввилите 40 микролитров нулевой части на миллион стандартов оксида дейтерия, а также завемите и сохраните спектры в качестве файла разделенных запятых значений. После введения и сохранения спектров всех стандартов для создания стандартной кривой, введать 40 микролитров каждого дистиллированного образца в жидкой клетке передачи, и сохранить спектры. С известным временем equilibration, общая вода тела, постная масса тела, и масса жира для одичал-уловленных больших коричневых летучих мышей и пленных больших коричневых летучих мышей можно определить.
Отрицательная жировая масса тела может быть рассчитана по одной или нескольких из следующих причин: не получать всю дозу оксида дейтерия, становится торпидной во время фазы эквилибрации, имея аномально большие жировые массы и минимальные постные массы, или имеющие под 3 до 5%тело жира, как это определено двойной рентгеновской абсорбции. Здесь показан репрезентативный процент жировых отложений, определяемый методом разбавления оксида дейтерия по сравнению с двойной абсорбциометрией рентгеновских лучей. Эти два метода хорошо коррелируют, с массой жира показывает сильную корреляцию между жиром и массой тела и с техникой разбавления оксида дейтерия не последовательно более или недооценки массы жира в организме.
Метод разбавления оксида дейтерия ранее был проверен у кошек, и метод был адаптирован, чтобы позволить измерение ежедневного потребления воды социально размещены кошки во время каждого диетического блока эксперимента. Помните, что этот метод должен быть выполнен только на здоровых животных, и что вы должны точно взвесить, записать, и доставить полную дозу оксида дейтерия для каждого животного. Вторичный метод определения состава тела, такой как полный анализ туши или DEXA, может быть завершен для проверки метода оксида дейтерия.
Этот метод позволил нам определить социально размещены кошки, которая потребляет аномально большое количество воды без разделения каждой кошки для измерения их потребления воды.
