이 프로토콜을 사용하여 방사성되지 않는 안정적인 물 동위원소인 D2O를 사용하여 신체 구성 및 물 소비를 추정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 비침습적이며 따라서 멸종 위기에 처한 종뿐만 아니라 인간과 국내 종에서 신체 구성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 중수소 산화 희석 기법을 독특하게 적용한 것은 높은 탈환률또는 사회적으로 수용된 동물의 자유 구역 야생 동물의 물 소비를 측정하는 능력입니다.
마취가 필요하지 는 않지만, 산화 신황을 전달하기 전에 동물을 진정시키기 위해 피하 주사를 주는 데 익숙하지 않은 사람들에게는 더 쉬울 수 있습니다. 사라 후퍼와 저와 함께 절차를 시연하는 것은 아만다 에셸만과 애슐리 코완, 수의학 학생, 그리고 내 실험실에서 대학원생 인 알리시아 로이스타처가 될 것입니다. 리터 염화물 산화당 9그램의 50밀리리터 스톡 솔루션을 만들기 위해 먼저 450밀리그램의 제약등급 염화나트륨을 계량하고 정확한 양을 4개의 소수점으로 기록합니다.
모든 소금을 멸균 된 100 밀리리터 비커로 옮기고, 멸균, 졸업 실린더에서 산화 99.8 %의 중수소보다 크거나 동일한 50 그램을 측정합니다. 정확한 양의 중수소산화물을 4개의 소수점으로 기록하고, 산화중류를 염화나트륨의 멸균 비커로 옮기다. 다음으로, 10밀리리터 주사기 배럴이 장착된 서브미크론 모공을 장착한 비피로게닉, 멸균 디스크 필터에 20게이지 바늘을 부착하고 바늘을 멸균, 비어 있는 100밀리리터 바이알의 중격에 삽입한다.
진공 튜브를 22 게이지 바늘에 부착하고 바늘을 100 밀리리터 바이알의 중격에 삽입합니다. 그런 다음 이소산 강도의 염화 나트륨 10 밀리리터를 주사기 배럴에 적재하고 중수소 산화물 용액이 바이알로 천천히 걸러지기 시작할 때까지 진공을 천천히 켭니다. 50밀리리터 부피가 여과될 때까지 중수소 산화물 스톡 솔루션을 주사기 배럴에 계속 붓습니다.
마취 된 박쥐에서 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 알코올 준비 패드를 사용하여 간부도 정맥을 통해 비로 파듐을 청소하고 소독 된 꼬리 멤브레인이 건조할 수 있도록하십시오. 간질로 된 석유 젤리를 간질 정맥 위에 바르고 29게이지 바늘을 사용하여 간부도 정맥의 등쪽 부분을 뚫는다. 그런 다음 플라스틱 나트륨 헤파린 모세관 튜브를 사용하여 100 마이크로 리터의 혈액을 수집합니다.
전체 혈액과 헤파린 나트륨의 적절한 혼합을 보장하기 위해 라벨링 하기 전에 혈액 수집 후 각 튜브를 부드럽게 굴리십시오. 주입하는 그램에 있는 중수소 산화물의 질량을 결정한 후에, 산화황의 적당한 양으로 29 게이지 바늘을 갖춘 인슐린 주사기를 적재합니다. 중수소로 적재된 인슐린 주사기와 바늘을 무게로 4개의 소수점으로 체중을 기록하고, 마취박쥐의 등산고 부위에 피하로 중수소산화물의 전체 부피를 주입한다.
정전기 방지 드래프트 쉴드가 있는 정밀 스케일을 사용하고 주입 전에 음압을 보장하기 위해 플런저를 다시 당기는 것이 좋습니다. 주사 직후, 지금 빈 인슐린 주사기와 바늘을 무게, 네 소수점 장소에 무게를 기록. 혈액 후 수집 후 30분 이내에 각 모세관 튜브를 5분 동안 10, 000배씩 회전하는 헤마토크트 원심분리기를 사용하십시오.
날카로운 가위를 사용하여 전체 혈액과 플라즈마 사이에 플라스틱 모세관 튜브를 자르고 200 마이크로 리터 파이펫을 사용하여 플라즈마를 라벨이 부착 된 500 마이크로 리터 저장 튜브로 직접 배출합니다. 평형 기간 후, 수집 하 고 그냥 입증 된 대로 상호 도덕적 맥락에서 혈액의 또 다른 100 마이크로 리터를 저장. FTIR 분광측분석 분석을 위해 모래 목욕의 온도를 섭씨 60도로 설정하여 증류를 용이하게 하고 각 플라즈마 샘플의 50마이크로리터를 개별 1.5밀리리터 원전 미세센티리후지 캡에 추가합니다.
마이크로센티페리지 캡을 거꾸로 유지하고, 1.5밀리리터 원추형 미세심분리기 튜브를 캡에 나사로 놓고, 역관을 모래 욕조의 모래와 접촉하여 최소 12시간 동안 배치한다. 다음 날 아침, 각 튜브에 새롭고 깨끗한 뚜껑을 놓고 마이크로 센심 분리기에서 10 초 동안 마이크로 센심 분리기를 펄스합니다. FTIR 분광계에 액체 전송 셀을 설치하고 세포를 메탄올로 채웁니다.
사출 포트를 연결하고, 기포의 위험을 줄이기 위해 메탄올 주사기를 조심스럽게 제거하면서 서서히 백그라운드물로 셀을 채웁니다. 분석 후 샘플을 제거하고 FTIR 분광계 소프트웨어를 열 수 있도록 출력 포트에 튜브를 부착합니다. 표에 따라 매개 변수를 설정하고 희석제, 0.22 마이크로미터 여과, 증류수를 사용하여 배경 샘플을 수집합니다.
백만 중수소 산화물 표준당 0 부품 40마이크로리터를 주입하고, 규마 분리값 파일로 스펙트럼을 기록하고 저장한다. 표준 곡선을 만들기 위해 모든 표준의 스펙트럼을 주입하고 저장한 후, 각 증류된 샘플의 40마이크로리터를 액체 전송 셀에 주입하고 스펙트럼을 저장합니다. 알려진 평형 시간으로, 야생 잡은 큰 갈색 박쥐와 포로 큰 갈색 박쥐에 대한 총 체수, 마른 체질량, 체지방 질량을 결정할 수 있습니다.
부정적인 체지방 질량은 다음 이유 중 하나 이상으로 인해 계산될 수 있습니다: 중수소산화물의 전체 복용량을 받지 못하고, 평형 단계에서 토피드가 되고, 비정상적으로 큰 지방 질량과 최소한의 마른 질량을 가지거나, 듀얼 엑스레이 흡수에 의해 결정된 바와 같이 체지방3~5% 미만이 있는 경우. 여기서, 이중 엑스레이 흡수법에 비해 중수소 산화물 희석 기술에 의해 결정된 체지방의 대표적인 백분율이 나타난다. 두 기술은 잘 상관, 체 지방 질량 체 지방과 체중 사이의 강한 상관 관계를 보여주는 그리고 중수소 산화 질소 희석 기술과 일관되게 과열 또는 체 지방 질량을 과소 평가 하지.
중수소 산화 희석 방법은 이전에 고양이에서 검증되었으며, 실험의 각 식이 블록 동안 사회적으로 수용 된 고양이의 일일 물 소비를 측정 할 수 있도록 기술이 적용되었습니다. 이 기술은 건강한 동물에서만 수행해야하며 각 동물에게 산화 중증화물의 전체 복용량을 정확하게 계량, 기록 및 전달해야한다는 것을 기억하십시오. 완전한 시체 분석 또는 DEXA와 같은 신체 조성을 결정하는 보조 방법은 중수소 산화물 기술을 검증하기 위해 완료될 수 있다.
이 기술을 통해 각 고양이가 물 소비량을 측정하기 위해 분리하지 않고 비정상적으로 많은 양의 물을 소비하는 사회적으로 수용된 고양이를 식별할 수 있었습니다.
