Ex vivo расширение гематопоэтической стволовой клетки из пуповинной крови имеют большие перспективы для применения HSC в регенеративной медицине и трансплантационной терапии. Этот протокол использовать цитокин коктейль в сочетании с вальпроевой кислоты лечения быстро расширить большое количество функциональных HSCs с характеристиками, которые очень напоминают первичные примитивные HSCs. Из-за быстрого воздействия вальпроевой кислоты лечения, этот метод также имеет потенциал для преодоления потери HSCs, связанных с редактированием генов.
Этот метод может быть полезен для генерации большего числа генетически модифицированных клеток в течение периода времени, который имеет отношение к используемым в настоящее время протоколам модификации генов. Протокол расширения вальпроевой кислоты ex vivo относительно прост и надежен. Очистка CD34-положительных клеток с устройством сепаратора клеток очень воспроизводима и быстра, что позволяет быстро восстановления высокоочищенные CD34-положительные клетки.
За 24 часа до изоляции положительных клеток CD-34 от пуповинной крови подготовья подготовьй буфер разделения, добавив два миллилитров 0,5 моларной ЭДТА и 33 миллилитров 7,5%BSA до 465 миллилитров 1X PBS. Смешайте буфер осторожно и поддерживать его на ночь при четырех градусах по Цельсию. В день очищения прогреть средства массовой информации до комнатной температуры.
Разбей всю пуповинной крови в колбу площадью 75 квадратных сантиметров. Разбавить кровь с равным объемом PBS при комнатной температуре и аккуратно перемешать. Затем определите количество трубок, необходимых для обработки всего пуповинной крови.
Добавьте 15 миллилитров градиентных средств плотности к каждой трубке. Распределяйте разбавленную кровь очень медленно поверх градиента плотности, удерживая трубку под углом 45 градусов, чтобы создать два слоя. Центрифуга трубки на 400 г в течение 30 минут с низким ускорением и замедлением скорости.
После центрифугации моноядерные клетки будут расположены в белом слое между слоями плазмы и градиента плотности. Тщательно перенесите слой баффи пальто в новую, 50-миллилитровую трубку. Соберите все моноядерные клетки из одного и того же пуповинной крови в 50-миллилитровую трубку до достижения 25 миллилитров.
Добавьте 25 миллилитров холодного PBS в трубку, содержащую 25 миллилитров моноядерных клеток, и хорошо перемешайте. Центрифуга при 400 г и при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут. Тщательно аспирировать супернатант и повторно помыть клеточные гранулы в 50 миллилитров холодного PBS.
После этого удалите 20 микролитров клеточной подвески для подсчета. Используйте автоматизированный счетчик клеток, чтобы подсчитать количество клеток, окрашенных либо акридин оранжевый или иодид пропидия и рассчитать общее количество моноядерных клеток. Затем центрифуга клетки на 400 г и при четырех градусах Цельсия в течение 15 минут.
Во-первых, смешайте 300 микролитров буфера разделения с 100 микролитров человека FCR человека IgG и 100 микролитров магнитных бусин CD34, чтобы изолировать CD34-положительные клетки от 10 миллионов моноядерных клеток. Затем осторожно удалите супернатант из трубки ранее центрифугированных моноядерных клеток. Повторное использование гранул в растворе магнитного шарика с использованием 500 микролитров на 10 миллионов клеток.
Смешайте осторожно и инкубировать при четырех градусах по Цельсию в течение 30 минут. Во время инкубации подготовьте устройство сепаратора ячейки, заменив решение для хранения рабочим буфером и запуская программу стирки с последующим программой полоскания. Затем добавьте сепаратор холодных клеток, работающий буфер, в трубку, которая содержит клеточную смесь, пока трубка не будет полностью заполнена.
Центрифуга трубки при 400 г и при четырех градусах по Цельсию в течение 15 минут. Аспирировать супернатант и повторно использовать клеточные гранулы в холодном сепараторе работает буфер с использованием двух миллилитров на 10 миллионов клеток. Перенесите смесь двухми миллилитровой клеточной суспензии в 15-миллилитровые трубки.
Загрузите три комплекта трубок в стойку сепаратора клеток, которая была предварительно охлажденной до четырех градусов по Цельсию. Один набор трубок содержит MMCs, второй набор труб будет использоваться для сбора отрицательной фракции, а третий набор труб будет использоваться для сбора очищенных CD34-положительных клеток. Загрузите стойку в устройство сепаратора ячейки и запустите заданную программу.
После этого центрифуга трубок, содержащих положительную фракцию при 400 г при и четырех градусах Цельсия в течение 15 минут. Аспирировать супернатант и повторно очистить очищенные CD34-положительные клетки в одном миллилитр сыворотки свободных средств массовой информации. Затем используйте автоматизированный счетчик клеток, чтобы подсчитать клетки, окрашенные акридин оранжевым или йодидом пропидия.
Во-первых, подготовить достаточный объем средств массовой информации для пластины очищенных CD34-положительных клеток при плотности 33 000 клеток на миллилитр. Плита очищенных CD34-положительных клеток в 12-хорошо пластины при плотности клеток 50000 клеток в 1,5 миллилитров средств массовой информации на колодец. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в 5%углеродного диоксида увлажненной инкубатор в течение 16 часов.
Добавьте вальпроевую кислоту в культуры таким образом, чтобы окончательная концентрация была одной миллимоляной. Продолжить культивирование клеток в тех же условиях в течение еще семи дней. В этом протоколе ex vivo увеличивается количество примитивных гематопоэтических стволовых клеток, генерируемых из CD34-положительных клеток, изолированных от пуповинной крови.
Общее количество нуклеированных клеток значительно выше в культурах, обработанных только цитокиновым коктейлем. Несмотря на большее количество ядерных клеток, количество гематопоэтических стволовых клеток в культурах, получающих только цитокиновый коктейль, остается низким в течение всего периода расширения, по сравнению с культурами, обработанными цитокиновым коктейлем и вальпроевой кислотой. Наибольшее количество гематопоэтических стволовых клеток генерируется в культурах, обработанных сочетанием цитокинового коктейля и вальпроевой кислоты.
В частности, наибольшее расширение достигнуто через пять-семь дней после лечения вальпроевой кислотой. Это увеличение числа гематопоэтических стволовых клеток коррелирует с быстрым увеличением доли гематопоэтических стволовых клеток, что примечательно в течение 24 часов после лечения вальпроевой кислотой. Хотя увеличение процента сохраняется в течение первых четырех дней культуры ex vivo, оно постепенно снижается после пяти-семи дней лечения.
Однако это снижение обратно коррелирует с увеличением абсолютного количества гематопоэтических стволовых клеток. Быстрое увеличение доли гематопоэтических стволовых клеток в вальпроико-кислотно-обработанных культурах связано с приобретением фенотипа CD90. CD34-положительные клетки, выражаюющие фенотипический маркер CD90, достигают почти 40-50% клеток, расширенных в культурах ex vivo, обработанных цитокиновым коктейлем и вальпроевой кислотой в течение четырех дней.
Приобретение фенотипа CD90 подтверждается расширением ex vivo высокоочищенные CD34-позитивные клетки, которые не имеют выражения маркера CD90. В течение 24 часов после лечения вальпроевой кислотой, почти 75% ex vivo расширенные клетки выражают CD90. Этот фенотип высоко сохраняется в течение первых четырех дней в этих культурах.
Разбавленная пуповинной крови следует распределять очень медленно на верхней части градиента плотности, удерживая трубку под углом 45 градусов, чтобы создать два различных слоя. После этой процедуры расширения ex vivo, расширенные клетки могут быть введены в миелоаблированных иммунодефицитных мышей NSG, чтобы проверить их функциональность и потенциал engraftment. Расширенные клетки могут быть использованы для проверки различных вопросов, касающихся биологии как человека, так и мыши HSC и роль различных генов или критического игрока на функциональную целостность HSCs.
Функциональность ex vivo расширена HSC из пуповинной крови человека, используя эту технику, в скором времени будет протестирована в клинических испытаниях у пациента с гематологическими злокачественными новообразованиями, которые требуют алогенной трансплантации костного мозга. Этот метод также позволил нам исследовать механизм, лежащий в основе расширения ex vivo с лечением VPA и получить представление о биологии примитивных HSCs.
