Мы уже давно занимаемся исследованиями биоматериалов, внедряя новаторскую концепцию материаловедов в области разработки вирусов, материалов для активного восстановления костей, а также технологов в области фактора роста, подготовки и активации. Мы разработали подход к остеоорганоидам in vivo с использованием биоактивных материалов для достижения производства ауто-узелков, тканей и клеток для лечения заболеваний по требованию. Традиционная технология индивидуальной экспансии стволовых клеток сталкивается с ограничениями в поддержании физиологических функций стволовых клеток.
Наш протокол конструирует микроокружение отдельных культур, чтобы обеспечить достаточное количество стволовых клеток с сохранением их стимула. Для начала поместите рекомбинантный раствор человеческого бульона и невскрытую желатиновую губку на стерильную чистую скамью. С помощью стерилизованных ножниц разрежьте желатиновую губку на 48 кусочков одинакового размера и переложите их на 48-луночную пластину.
Пипеткой несколько раз нанесите рекомбинантный человеческий раствор и тщательно перемешайте его. Отсадите 30 микролитров раствора и добавьте его по каплям в желатиновую губку. Затем запечатайте 48-луночную пластину слоем парапленки.
Снимите тарелку с чистой скамейки и поставьте ее при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Для начала перенесите мышь под наркозом в операционную зону и расположите ее в правом боковом лежачем положении для легкой имплантации биоактивного каркаса в левую ногу. С помощью бритвенного станка сбрейте волосы на левой ноге и продезинфицируйте выбритый участок, чередуя раунды хлоргексидина и спирта, по три раза каждый.
После выполнения разреза введите офтальмологические ножницы в мышцу мешочка по направлению большеберцовой кости, чтобы обеспечить пространство для последующей имплантации материала. Теперь возьмите подготовленный биоактивный каркас, загруженный рекомбинантным человеческим и, используя офтальмологические щипцы, зажмите его в цилиндрическую форму. Вживите каркас в мышечный карман по созданной ранее щели.
После 12 недель имплантации сделайте мышь под наркозом и осторожно отделите заднюю конечность от туловища. С помощью миниатюрных ножниц скрупулезно удаляют мышечную ткань из остеоорганоидов. Удалите все прикрепленные мягкие ткани с помощью марли, чтобы обеспечить чистоту образца остеоорганоидов.
Зафиксируйте часть остеоорганоидов в 4%-ном растворе параформальдегида в течение 24 часов при комнатной температуре для проведения гистологического анализа. Для начала соберите остеоорганоиды у мышей, которым имплантировали каркас, содержащий рекомбинантные человеческие остеоорганоиды, в ступку и добавьте один миллилитр HBSS, без ионов кальция и магния. С помощью хирургических ножниц измельчите образцы, а затем аккуратно раздавите их в ступке и пестиком.
Пропустите полученный в клеточной суспензии через клеточный фильтр толщиной 40 микрометров. Затем центрифугируйте его при 300 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После этого выбросьте надосадочную жидкость.
Повторно суспендируйте клеточные гранулы в 300 микролитрах HBSS и хорошо перемешайте для получения равномерной клеточной суспензии. Поместите мышь под наркозом, подвергшуюся смертельному облучению, на грелку с температурой 37 градусов Цельсия. После обеспечения полной анестезии расположите мышь в левом боковом положении лежа так, чтобы ее голова была направлена вправо.
С помощью одномиллилитрового шприца с иглой 25-го калибра аспирируйте 200 микролитров приготовленной клеточной суспензии. Чтобы обнажить глаз для процедуры, поместите палец на макушку головы и вдоль линии подбородка, а затем аккуратно потяните кожу назад и вниз. Осторожно введите иглу фаской вниз в медиальный кантус глаза под углом примерно 30 градусов.
Аккуратно проследите иглой по контуру глазного яблока, пока оно не достигнет основания глаза. Вводите клеточную суспензию плавно и медленно в обозначенную область. После завершения инъекции верните мышь в клетку, чтобы дать ей возможность восстановиться.
