Этот протокол может быть использован для изучения молекулярных и клеточных изменений, которые происходят во время нормальной миелоидной дифференциации человека CD34 положительные гематопоэтические стволовые и клетки-предшественники. Основным преимуществом этого протокола является то, что он позволяет дифференцировать CD34 положительные клетки по всем четырем миелоидных линий, включая мегакариоциты, эритроциты, гранулоциты и моноциты. Демонстрация процедуры будет Адити Бапат, пост-док из моей лаборатории.
Для моноядерной изоляции клеток от человеческого пуповинной крови, стерилизовать внешнюю поверхность мешка пуповинной крови с 70% этанола перед передачей содержимого мешка в стерильные 250 миллилитров пластиковой бутылки в биологическом шкафу безопасности. Разбавить кровь с равным объемом комнатной температуры Хэнк буферный солевой раствор, и добавить 15 миллилитров моноядерной клеточной фракционной среды к каждому из пяти стерильных 50 миллилитров конических труб. После нежного смешивания, тщательно залить 30 миллилитров разбавленной пуповинной крови на моноядерной среды фракции в каждой трубке, держа 50 миллилитров труб под углом, чтобы помочь избежать смешивания слоев.
Разделите клетки по плотности градиентной центрифугации и удалите верхние 15-20 миллилитров плазмы над моноядерным слоем клеток. Используйте пипетку, чтобы тщательно перенести открытый слой моноядерных клеток в новую 50-миллилитровую трубку, объединить моноядерные клетки из двух-трех трубок вместе, и довести окончательный объем в каждой трубке до 50 миллилитров с холодным буфером PBE. Пеллет моноядерных образцов клеток центрифугации, и аспирировать supernatants.
Нажмите каждую трубку осторожно, чтобы ослабить гранулы клетки, и разбавить гранулы в пять миллилитров ледяного буфера PBE. Объедините клетки от трех до четырех трубок в одну 50-миллилитровую коническую трубку и промойте все трубки пятью миллилитров свежего буфера PBE, чтобы собрать оставшиеся клетки. После подсчета, довести окончательный объем в трубке до 50 миллилитров со свежим ледяным буфером PBE, и собирать клетки центрифугации.
Чтобы изолировать положительные моноядерные клетки CD34, повторно приостанавливайте гранулы в 50 миллилитров свежего буфера PBE перед сбором клеток с другой центрифугации. После отбрасывания супернатанта, нажмите осторожно, чтобы ослабить гранулы, и повторно приостановить клетки в один раз от 10 до восьми моноядерных клеток на 300 микролитров ледяной концентрации буфера PBE. Блокировать любые неспецифические связывания с 100 микролитров рецептора Fc блокирования реагента, смешать осторожно, а затем добавить 100 микролитров CD34 микробусов из магнитной активированной клетки сортировки человека CD34 микроприбы комплект на один раз 10 до восьми клеток с нежным смешивания, и инкубировать клетки в течение 30 минут при четырех градусах по Цельсию.
В то время как клетки инкубируются, поместите столбец LS и фильтр предварительного разделения в магнитное поле сепаратора MACS. Equilibrate столбец с двумя миллилитров ледяного буфера PBE и до разделения фильтра с одним миллилитров буфера. Разрешить столбец опорожнить в 15 миллилитров конической трубки и отказаться от потока через.
В конце инкубации довести окончательный объем образца моноядерных клеток до 15 миллилитров со свежим ледяным буфером PBE и отложения клеток центрифугированием. Повторно приостанавливайте гранулы в один миллилитр ледяного буфера PBE и загружайте ячейки на фильтр предварительного разделения на столбце. Промыть трубку тремя миллилитров свежего ледяного буфера PBE и добавить буфер к фильтру предварительного разделения.
Вымойте столбец четыре раза с дополнительными тремя миллилитров ледяного буфера PBE на стирку без фильтра, что позволяет столбец полностью стечь между каждой стирки. После окончательной стирки, переместить колонку в новую 15 миллилитровую трубку, и окунуться пять миллилитров свежего ледяного PBE через колонку в трубку. Для определения фракций стволовых и прародителей популяций в недавно изолированных CD34 положительных гематопоэтических стволовых и прародителей клеток, собирать клетки центрифугации и повторно приостановить гранулы в один раз от 10 до шести клеток на 50 микролитров концентрации цитометрии потока.
Далее, передача клеток в 50 микролитр aliquots на пять миллилитров флуоресценции активированной клеточной сортировки трубки в соответствии с экспериментальным протоколом окрашивания цитометрии потока. Добавьте соответствующий коктейль антитела и живое/мертвое окрашивание в клетки, регулируя громкость до 100 общих микролитров. После 20 минут в темноте защищены от света, мыть клетки с одним миллилитр свежего потока цитометрии буфера на трубку, и повторно приостановить клетки в 500 микролитров свежего потока цитометрии буфера на трубку.
Затем проанализируйте клетки на цитометре потока в соответствии со стандартными цитометрическими протоколами потока. Чтобы дифференцировать микробус изолированных CD34 положительных стволовых и прародителей клеток в клетки миелоидной линии, сначала пальто скважин стерильных, неокрашенных 48-хорошо пластины с 200 микролитров на колодец рекомбинантного человеческого фибронектина раствора в PBS в течение двух часов при комнатной температуре. В конце инкубации отбросьте раствор фибронектина из каждой скважины и блокируйте скважины 200 микролитров 2%бычьего альбуминового сыворотки.
После 30 минут при комнатной температуре, мыть колодцы два раза с 500 микролитров стерильных PBS за стирку. Повторно приостанавливать свежеиспеченные CD34 положительные клетки в пять раз 10 пять клеток на миллилитр теплой стимуляции средней концентрации. Далее, семена 200 микролитров клеток в каждом колодец из фибронектина фрагмент покрытием пластины и место пластины в инкубаторе культуры клеток в течение 48 часов.
В конце инкубации соберите клетки с нежной трубой и помойте колодцы 500 микролитров разогретой среды Орла Дульбекко, скопив мойки с клеточной подвеской. После подсчета, повторно приостановить клетки в 2,5 раза 10 до четырех клеток на один миллилитр миелоидной дифференциации средней концентрации. Слой 200 микролитров CD34 положительных клеток на колодец в стромальной клетке MS-5 посеяны 48 хорошо пластины культуры тканей.
Затем поместите пластину в инкубатор клеточной культуры, аккуратно заменив 100 микролитров супернатанта в каждой колодец 100 микролитров свежей 2X миелоидной дифференциации среды каждые три-четыре дня. На 21 день, урожай клеток для анализа экспрессии маркера миелоидной линии потока цитометрии, как только что продемонстрировали. Типичный процент от общего числа CD34 положительных клеток, изолированных из пуповинной крови по разделению микробусов, как попродемонстрировано колеблется от 80 до 90% Иммунофенотипический анализ показывает, что эти CD34 положительные клетки обычно состоят из примерно 20%lineage отрицательных CD34 положительные CD38 отрицательной популяции гематопоэтических стволовых клеток и 72%lineage отрицательный CD34 положительный CD38 положительной многопотонной популяции клеток-предшественников.
В многопотенциозной популяции клеток-предшественников около 25% клеток выражают общие маркеры миелоидных прародителя, около 15% выражают маркеры прародителя моноцитов гранулоцитов и около 56% выражают маркеры эритроидов мегакариоцитов. Иммунофенотипинг также показывает, что процент положительных клеток CD34 уменьшается примерно с 90% при изоляции до менее 25% в день 21. Анализ отрицательной популяции CD34 показывает сопутствующий рост доли клеток, выражаюющих зрелые маркеры линии миелоидов.
Кроме того, окрашенные клетки Райта-Гимса демонстрируют различные морфологические характеристики в дни один и 21 с недифференцированными культурами, экспонированием больших, круглых ядер и очень мало цитоплазмы и дифференцированных культур, отображающих морфологические характеристики клеток линии, включая моноциты, гранулоциты и эритробласты. Не забудьте залить разбавленную пуповинной кровью на моноядерные клеточные фракционной среды без смешивания слоев, и не беспокоить MS-5 и CD34 положительных клеток при изменении среды. Следуя этому протоколу дифференциации, положительные клеточные культуры CD34 могут быть проанализированы на морфологические изменения, апоптотические эффекты, изменения в моделях клеточного цикла и степень дифференциации.
