Диагноз болезни Паркинсона по-прежнему опирается на клинические признаки двигательного участия, которые появляются позже в ходе заболевания, когда большинство нейронов substantia nigra уже потеряны. Этот протокол позволяет анализ кожных нервов биопсии кожи, которая представляет собой потенциальный новый биомаркер болезни, которые будут использоваться в клинических испытаниях. Биопсия кожи является легко поддаемой оценке, неинвазивной процедурой, которая позволяет проводить анализ периферической нервной ткани, подверженной патологии.
Альфа-синуклеин агрегатов обнаружения биопсии кожи могут быть использованы для диагностических целей, возможно, на ранних стадиях, когда потенциальное лечение является наиболее эффективным. Последующие биопсии кожи у одного и того же пациента позволяют провести время и специальный анализ курса альфа-синуклеина агрегата, распространяемого в кленовой нервной системе человека. Они могут пролить свет на патогенез болезни.
Чтобы начать эту процедуру, подготовьте новое фиксативное решение PLP, изложенное в таблице 1 текстового протокола. Сразу после сбора биопсии кожи, погрузить его в трубку, содержащую 10 миллилитров фиксаторного раствора. Инкубировать на ночь при четырех градусах по Цельсию.
На следующий день, в дым капот, удалить PLP фиксатор осторожно. В той же трубке, мыть биопсию три раза в течение пяти минут каждый, используя пять миллилитров раствора 0,1 молара Соренсена для каждой стирки. Откажитесь от раствора Соренсена и добавьте пять миллилитров криопротекторного раствора.
Инкубировать на ночь при четырех градусах по Цельсию. На следующий день, хранить биопсии на четыре градуса по Цельсию, если разрез с криотомом должен быть выполнен в течение одной недели. Во-первых, установите криотом до минус 20 градусов по Цельсию.
Возьмите криомольд и заполните его крио-встраиванием среды. Используя пинцет, погрузите биопсию в крио-встраивание среды, с продольной оси параллельно нижней части криомольда. Snap заморозить образец с жидким азотом, чтобы получить твердый куб крио-встраивания среды, содержащей биопсии в правильной ориентации.
Положите образец в криостат и подождите 30 минут, чтобы биопсия акклиматизировалась. Затем зафиксв образец на криостатре и разрежьте на 50-микрометровые секции. Используя небольшую кисть, перенесите крио-секции на пластину 96-колодец, содержащую 200 микролитров раствора антифриза в каждой хорошо.
После этого храните тарелку при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Для начала заполните некоторые колодцы свежей пластиной 96 скважин со 100 микролитров стирального раствора. Перенесите секции, которые будут проанализированы с пластины хранения, на тот, который содержит стиральный раствор.
Оставьте секции в стиральном растворе на 10 минут при комнатной температуре. Затем перенесите каждый раздел в пустой колодец, содержащий тот же раствор для мытья, и повторите стирку. Далее добавьте стиральный раствор в секции и перенесите их в новые скважины, содержащие 100 микролитров блокирующего раствора.
Инкубация при комнатной температуре не менее 90 минут и максимум четыре часа. Разбавить первичные антитела, анти-PGP9.5 и анти-5G4, в рабочем растворе. Перенесите секции в новые скважины, содержащие 100 микролитров рабочего раствора первичных антител, и инкубировать на ночь при комнатной температуре.
На следующий день мыть секции в колодцах, содержащих стиральный раствор, как описано ранее. Разбавить вторичные антитела, Коза анти-Rabbit для обнаружения PGP9.5, и коза анти-мышь для обнаружения 5G4, в рабочем растворе. Перенесите промытые секции в новые скважины, содержащие 100 микролитров рабочего раствора вторичных антител.
Накройте пластину алюминиевой фольгой, чтобы избежать отбеливания флюорофора, конъюгированных вторичными антителами, и инкубировать при комнатной температуре в течение 90 минут. После этого, мыть разделы два раза в стиральном растворе, как описано ранее. Перенесите промытые секции в новые колодцы, содержащие 100 микролитров DAPI, в течение пяти минут при комнатной температуре.
Вымойте секции два раза в стиральном растворе, как описано ранее. Затем смонтировать секции на слайде в правильном положении, избегая неправильного сфоливания. Добавьте несколько капель монтажной среды к слайду и накройте секцию крышкой.
Пусть слайды высохнут на ночь. На следующий день храните слайды в соответствующей коробке при четырех градусах по Цельсию, чтобы избежать воздействия света. Используя перевернутый флуоресцентный микроскоп или конфокальный микроскоп, просмотрите разделы.
Приобретайте изображения с помощью камеры, подключенной к микроскопу. Затем используйте флуоресцентный микроскоп или конфокальный микроскоп для анализа положительных сигналов в разделах с точки зрения пространственного распределения и интенсивности сигнала, как указано в текстовом протоколе. Следуя описанного метода, альфа-синуклеин агрегаты помечены 5G4 антитела обнаруживаются в кожных нервных фасциклов иннерватирования вегетативных структур PD пациентов.
Морфология отложения альфа-синуклеина появляется как пунктирный сигнал вдоль аксонов кожных нервов. Представительное использование этого протокола у 19 пациентов PD и 17 элементов управления биопсией кожи на трех анатомических участках показывает, что 5G4 имеет чувствительность 81% и специфичность 86% по сравнению со здоровым контролем. Фосфорилированный альфа-синуклеин имеет чувствительность 56%и специфичность 100%5G4 и фосфорилированные альфа-синуклеин-положительные отложения находятся в основном вокруг потовых желез, но также находятся в мышечных арректорных пили, мелких сосудах и субэпидерном и дермальное сплетение, но никогда не в внутриэпидерном нервных волокнах.
Как правило, в потовых желез люмена, можно наблюдать неспецифический сигнал, который может быть неправильно истолкован как 5G4 или фосфорилированной альфа-синуклеин положительность. Этот тип сигнала пунктирный, сферический, и это связано, скорее всего, с интралюминальным аутофлюоресцентным материалом, как попродемонстрировано в техническом контроле без первичных и вторичных антител. Колокализация с PGP9.5, которая отмечает нервные волокна, которые морфологически являются нитейными и удлиненными, помогает определить правильный сигнал.
Таким образом, специфичность сигнала 5G4 значительно увеличивается двойным иммуностимулятором с аксональным маркером. Точная фиксация биопсии необходима для производства качественного иммунофлуоресцентного окрашивания и для надежной интерпретации флуоресцентных сигналов. Если фиксатор не подготовлен правильно, или если произошла чрезмерное фиксация, результатом будет высокая аутофторесценция, которая будет маскировать сигнал нервных волокон, пересекающих дермальной эпидермальной развязке, или innervate основных кожных структур.
Наиболее важным шагом этой процедуры является фиксация тканей. Обратите внимание на рН фиксативного раствора PLP и сроки инкубации, чтобы избежать аутофторесценции и конкретного сигнала.
