Протокол позволяет проводить оценку реакции принимающей стороны на различные патогенные микроорганизмы и составы вакцин. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет оценки бактериальной нагрузки и иммунных реакций in vivo, используя урожаемую модель животных. Демонстрируя эту процедуру, Кейси Yount, аспирант из моей лаборатории.
Для иммунизации подтвердите отсутствие реакции на щепотку ноша в обезболивающей мыши шести-двенадцати недель и загрузите один миллилитр инсулиновый шприц, оснащенный иглой 28,5 калибра с 0,1 миллилитров вакцины, представляющих интерес. Держа шприц под углом 45 градусов, с скошенной лицом вверх, вставьте иглу примерно пять миллиметров в дельтовидную мышь и ввините вакцину. Держите иглу вставляется в мышцу в течение пяти-десяти секунд, а затем поверните шприц 180 градусов, так что скошен сталкивается вниз, чтобы создать уплотнение, и для предотвращения утечки вакцины, прежде чем медленно убирая иглу из места инъекции.
Затем верните мышь в клетку, с наблюдением, до полного выздоровления. Примерно через две недели после повышения, заразить иммунизированных мышей. Возьмите обезболивающее мышь за потертости спинной грудной клетки, за лопатками и шеей, и распоить мышь вертикально, чтобы получить доступ к носу.
Используя наконечник пипетки из 200 микролитров, медленно нанесите от 20 до 25 микролитров бактериального инокулума, представляющих интерес для каждого нара животного, удерживая мышь до тех пор, пока весь инокулум не будет вдыхаться. Затем доставить равный объем стерильных PBS для одной группы мышей в качестве отрицательного контроля. В соответствующей экспериментальной конечной точке поместите инфицированную мышеловую вентральную сторону на доску для вскрытия и закрелите конечности.
Влажные тела с 70% этанола, и использовать миппы, чтобы застегнуть кожу ниже живота в центре таза. Используя острые ножницы, сделать вертикальный разрез до челюсти, и вскрыть кожу от брюшной стенки. Переместите кожу в стороны туши, чтобы создать беспрепятственное поле для стерильного сбора органов, и схватить нетронутыми брюшной полости ниже грудной клетки, на или вблизи печени.
Вырезать брюшной полы к грудной клетке подвергать нижней пищеварительного тракта, и переместить толстой кишки влево, чтобы выявить селезенки. Используя изогнутые типсы, схватите селезенку и рассеките соединительной ткани ножницами. Затем поместите селезенку в 15 миллилитровую коническую трубку, содержащую 3 миллилитров RPMI, и 5%фетальной сыворотки крупного рогатого скота на льду.
Используйте типсы, чтобы стабилизировать грудную клетку при процессе ксифоида, и разрезать диафрагму. Легкие должны сдуваться и падать в сторону позвоночника. Разрежьте грудную клетку по бокам, чтобы удалить нагрудный знак, и вырезать легочных артерий и вен, чтобы изолировать и удалить верхний доли правого легкого.
Зафиксируйте долей в 15 миллилитровой конической трубке 10%neutral буферного формалина при комнатной температуре, по крайней мере 24 часов, и изолировать оставшиеся доли правого и левого легких. Затем поместите доли в 15 миллилитров конической трубки, содержащей два миллилитров 1%casein в PBS на льду. Используйте один миллилитр пипетки с наконечником, чтобы собрать кровь заполнения грудной полости, и передать кровь в предварительно помечены 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки на льду.
Удалите околоушные, сублингвальные и субмаксилярные железы и лимфатические узлы, покрывающие трахею, и откройте и удалите защитные мембраны, окружающие трахею. Используя тонкие типсы и ножницы, тщательно отделяйте трахею от пищевода и любой другой соединительной ткани от верхней части ключицы до нижней челюсти. Используйте типсы, чтобы держать трахею, и вырезать трахею в верхней части ключицы.
Потяните вниз трахею, чтобы максимизировать эластичность, и вырезать трахею в нижней части нижней челюсти, прямо над гортани, изолируя около одного сантиметра ткани. Затем поместите орган в предварительно помеченную 1,5 миллилитровую микроцентрифугную трубку, содержащую 0,3 миллилитров 1%casein в PBS на льду. Теперь поверните мышь для четкого доступа к носу, и распылить голову с 70% этанола.
Вручную схватить животное прямо за черепом, и использовать ножницы, чтобы отрезать мягкую плоть морды, начиная от нижней части носа и двигаясь вверх. Удалите мех, кожу и усы со всего носа, и вставьте кончики изогнутых ножниц в nares с кривыми указал вниз. Разрежьте носовой проход к глазам, создавая V-подобное образование.
Затем используйте тонкие миппы для сбора носовой перегородки и мягких тканей в рамках формирования, и поместите ткань в предварительно помеченную 1,5 миллилитровую микроцентрифугную трубку, содержащую 0,3 миллилитров 1%casein в PBS, на льду. Для обработки легочной ткани, передать все содержимое трубки образца легких в стерильные 15 миллилитров Dounce гомогенизатор, и использовать пестик для гомогенизации ткани. Отмежевать образец до тех пор, пока не останутся крупные частицы ткани, и вернуть гомогенизированную суспензию в оригинальную 15 миллилитровую трубку.
Удалите 0,3 миллилитров алицита для покрытия единиц колонии формирования, а также собирать остальную часть гомогената центрифугации. Aliquot 0,5 миллилитров супернатанта в предварительно помеченные микроцентрифуговые трубки для хранения при 20 градусах по Цельсию до анализа экспрессии цитокинов Элизой. Затем, последовательно разбавить 0,1 миллилитров aliquots отведенных в сторону гомогенизированной подвески легких в 0,9 миллилитров стерильных PBS на разбавление, и использовать стерильный треугольник распространитель пластины 0,1 миллилитров каждого эмпирически выбранного разбавления на предварительно помечены 10%Bordet-Gengou плюс стрептомицин пластин.
Здесь показаны репрезентативные оптические измерения плотности 600 измерений и расчетов для достижения одной оптической плотности бактериальной суспензии, для подготовки стократного разбавленного бактериального инокулума для доставки мышам. После семи дней стимуляции антигена вакцины, иммунизированные клетки селезенки из комбинированной группы вакцины производят интерферон гамма, и IL17, в то время как значительно вниз регулирования IL5, содействие T помощник, один T помощник 17 поляризации иммунного ответа во время инфекции Коклюша B. Колония формирования единицы перечисления бактерий, восстановленных в дыхательных путей вопросы B коклюша инфицированных мыши могут быть использованы для оценки защитных эффектов вакцины интереса.
Работайте как можно быстрее и эффективнее, чтобы избежать некроза тканей, и храните изолированные ткани на льду, чтобы сохранить жизнеспособность восстановленных бактерий. Цитометрия потока ELISpot и изоляция ДНК и РНК могут быть выполнены для оценки иммунных клеток, аналитического производства, а также для обеспечения эпигенетических и транскриптомных анализов. При работе с инфекционными агентами, такими как коклюш Bordetella, важно помнить, чтобы носить соответствующие СИЗ, и работать в сертифицированном кабинете биобезопасности для предотвращения передачи патогенов.
Этот протокол подробно CFU перечисления из дыхательных путей, в частности носовой глотки. Для решения вопросов в области вакцин и инфекционных заболеваний о ориентации бактериальной колонизации в носу.
