Частицы липопротеинов являются родными транспортными средствами. Обогащение иностранных веществ облегчает их использование в качестве трек-носителя. Специфическая маркировка молекул или целых частиц позволяет измерить поглощение клеток.
Эти два метода обогащения являются быстрыми и простыми в использовании и могут быть адаптированы для широкого спектра веществ. Демонстрацией процедуры будут Маркус Аксман и Андреас Карнер, два постдока из моей лаборатории. Чтобы начать делипидацию в дымовом капюшоне, смешайте от одного до двух миллилитров подготовленного раствора ЛПВП, содержащего пять миллиграммов частиц ЛПВП, с 50 миллилитров предварительно охлажденой смеси этанола дитилового эфира в конической центрифугированной трубке.
Инкубировать в течение двух часов при минус 20 градусах по Цельсию. Центрифуга при 2500 раз г в течение 10 минут при отрицательных 10 градусах по Цельсию. Отбросьте супернатант, повторно посовещенные гранулы в 50 миллилитров предварительно охлажденого этанола дитил эфирной смеси, и вихрь кратко.
Инкубировать второй раз в течение двух часов при отрицательных 20 градусов по Цельсию. Центрифуга снова при 2500 раз г в течение 10 минут при отрицательных 10 градусах по Цельсию. Затем вставьте трубки, снабжающие поток азотного газа для высыхания гранул.
И повторно использовать его в 250 микролитров буфера A.Определить концентрацию белка с помощью анализа белка Брэдфорд или другой соответствующий. Очень важно удалить любые остатки смеси этанола дитетил эфира, так как эти растворители будут препятствовать релиппидации аполипопротеинов. Далее разбавляют до конечной концентрации одного миллиграмма белка на 250 микролитров буфера A.Insert труб, снабжающих инертным газом растворную часть в трубке.
При необходимости храните раствор на ночь при четырех градусах Цельсия под инертной газовой атмосферой. Для начала восстановления в чистой стеклянной трубке смешайте 100 микролитров CO, 13,5 микролитров C и 500 микролитров ПК. Затем поверните стеклянную трубку во время промывки азотного газа внутри трубки, чтобы высушить смесь, чтобы дать однородный поверхностный слой. В 0,5-миллилитровой реакционной трубке приготовьте свежий 30-миллимолярный раствор спермина в буфере A.Then смешайте 100 микролитров 10-микромолярной синтетической микроРНК со 100 микролитров раствора спермина в двухми миллилитровой реакционной трубке.
И инкубировать в течение 30 минут при 30 градусах по Цельсию. Затем перенесите инкубационный 200-микролитровый раствор в стеклянную трубку для регидратации подготовленного поверхностного слоя PC-CO-C mastermix. А затем добавьте 50 микролитров раствора 30 миллиграммов на миллилитр натрия дезоксихолата.
Перемешать при четырех градусах по Цельсию в течение двух часов. После этого добавьте в стеклянную трубку 250 микролитров раствора ЛПВП. И перемешать при четырех градусах по Цельсию на ночь.
Чтобы начать диализ, сначала добавьте 50 граммов адсорбентных бусин до 800 миллилитров двойной дистиллированной воды. И использовать магнитный мешалка, чтобы перемешать в течение одной минуты. Подождите 15 минут для бисера, чтобы поселиться, и decant супернатант.
Повторите процедуру с предварительно охлажденным PBS. Предварительно влажные кассеты диализа в PBS. Используйте шприц, чтобы добавить ранее подготовленную смесь в кассеты в соответствии с инструкциями производителя.
Добавьте обработанные PBS адсорбентные бусы к трем литрам PBS и поместите кассеты в PBS для диализу при четырех градусах Цельсия. Бусинки держат градиент плотности вдоль мембраны диализа постоянным. Измените буфер и шарики через час и два часа.
Через 24 часа, со шприцем, извлечь раствор из кассеты в 1,5-миллилитровую реакционную трубку, чтобы восстановить восстановленный раствор частицы ЛПВП. Определите концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда. Поставь инертный газ в реакционную трубку, запечатать его и хранить восстановленный раствор частиц ЛПВП под инертной газовой атмосферой при четырех градусах Цельсия.
Во-первых, подготовить свежий 30-миллимолярновый раствор спермина в безрновой воде. Смешайте 100 микролитров 10 микромоляров синтетической микроРНК со 100 микролитров раствора спермина в двухми миллилитровой реакционной трубке. И инкубировать в течение 30 минут при 30 градусах по Цельсию.
Затем добавьте 100 микролитров DMSO и 1,2 миллилитров буфера 1X LDL в подготовленный раствор спермина микроРНК. Разбавить ранее подготовленный раствор частиц ЛПНП с ПОМОЩЬю PBS до конечной концентрации около четырех миллиграммов на миллилитр. Затем нарисуйте 450 микролитров разбавленного раствора в 1,5-миллилитровую реакционной трубку и смешайте с 50 микролитров буфера 10X LDL.
Инкубировать его в течение 10 минут на льду. После инкубации смешайте 500-микролитрный раствор частиц ЛПНП и 1,5-миллилитровый раствор микроРНК-спермин-ДМСО и инкубировать его в течение двух часов при 40 градусах Цельсия. Выполните диализ, подобный ранее описанного, и храните помеченный раствор частиц ЛПНП под инертной газовой атмосферой при четырех градусах Цельсия.
Для начала разбавляют раствор частиц ЛПВП или ЛПНП в PBS от одного до 100 и от одного до 1000. Клив слюды, нажав клейкой лентой против слюды субстрата, и потянув ленту, чтобы удалить верхние слои слюды. Используйте пипетку, чтобы внести два микролитера на свежевыжатую слюду, чтобы инкубировать в течение пяти минут.
Частицы липопротеинов, как правило, образуют мембраны непрерывной связи на поверхностях. Следовательно, важно регулировать концентрацию частиц на поверхности слюды, чтобы получить отдельные. После инкубации, промыть образец с PBS.
Заполните высокоскоростную жидкостную ячейку AFM с помощью PBS и смонтировать сканер слюды на высокоскоростной этап AFM. В программном обеспечении управления, начать процесс подхода кантилевера к поверхности слюды. Используйте размеры сканирования менее одного квадратного микрометра и сохраняйте силы визуализации как можно ниже.
Изображение образца в режиме касания. Загрузите данные в Gwyddion и обнаружить частицы с помощью зерна знака по пороговой функции. Отрегулируйте значение порога высоты, чтобы замаскировать отдельные частицы.
Как правило, уровень около 50% является хорошей отправной точкой. Удалите полиномиальный фон, чтобы сгладить изображение, и активируйте опцию исключить область с маской. Экспортйте максимальные значения высоты обнаруженных частиц, используя функцию распределения различных характеристик зерна, и повторите эти шаги для всех записанных изображений.
В этом эксперименте, восстановление частиц ЛПВП было выполнено путем делипидации частиц ЛПВП, а затем релипидации и диализа. Выход 50% восстановленных частиц ЛПВП может быть достигнут. Тем не менее, та же маркировка микроРНК не представляется возможным для маркировки частиц ЛПНП, из-за гидрофобности белка аполипопротеина B100.
Таким образом, DMSO был использован для проникновения липидного монослоя частиц ЛПНП, с выходом близко к 100% Во время контроля качества, разбавление имеет решающее значение для анализа. На верхнем изображении показана слишком высокая плотность частиц. Нижнее изображение подходит для анализа.
Функции плотности вероятности высот частиц были рассчитаны для сравнения распределения размеров родных, помеченных и помеченных контрольных частиц липопротеинов. Относительное изменение до и после процедуры маркировки является пренебрежительной. При обработке РНК-олигонуклеотидов, работа RNAse-бесплатно.
Используйте свежие одноразовые пластиковые расходные материалов, и всегда носить перчатки. Используйте только решения без нуклеаз. Высокоскоростной AFM является лишь одним из методов определения общей формы липопротеинов.
Альтернативным методом была бы электронная микроскопия. Носите соответствующее оборудование личной защиты, и работать в дым капот при обработке дитетил эфира.
