Lipoprotein parçacıkları yerli taşıma araçlarıdır. Yabancı maddelerin zenginleşmesi, palet taşıyıcısı olarak kullanımını kolaylaştırır. Moleküllerin veya bütün parçacıkların özel olarak etiketlemi hücresel alımının ölçülmesini mümkün kılar.
Zenginleştirme için iki yöntem hızlı ve kullanımı kolaydır ve maddelerin geniş bir yelpazede için adapte edilebilir. Prosedürü gösteren Markus Axmann ve Andreas Karner, laboratuvarımdan iki doktora sonrası. Duman kaputunda delipidasyona başlamak için, beş miligram HDL partikülü içeren bir ila iki mililitre uzunluğundaki HDL çözeltisini, konik bir santrifüj tüpünde önceden soğutulmuş üç-iki etanol etil eter karışımıile 50 mililitre HDL parçacıklarını karıştırın.
Negatif 20 derecede iki saat kuluçkaya yat. 2500 kez g'de 10 dakika boyunca negatif 10 santigrat derecede santrifüj. Supernatant atın, önceden soğutulmuş etanol etil eter karışımı 50 mililitre pelet resuspend, ve girdap kısaca.
Negatif 20 santigrat derecede iki saat boyunca ikinci kez kuluçkaya yat. Negatif 10 santigrat derece 10 dakika için 2500 kez g tekrar santrifüj. Sonra pelet kurutmak için azot gazı akışı sağlayan tüpler ekleyin.
Ve 250 mikrolitre tampon A.Bradford protein isay'ını ya da uygun bir tanesini kullanarak protein konsantrasyonu belirleyin. Bu çözücüler apolipoproteinlerin relipidasyon inhibe edeceğini gibi, etanol diethyl eter karışımı nın herhangi bir kalıntıları kaldırmak için önemlidir. Sonra, tampon A.Insert bir tüp tüp çözelti parçası içine inert gaz sağlayan bir tüp eklemek başına protein bir miligram son konsantrasyonu seyreltin.
Gerekirse, solüsyonu bir gecede, inert gaz atmosferinin altında dört santigrat derecede saklayın. Yeniden yapılmaya başlamak için, temiz bir cam tüpte 100 mikrolitre CO, 13,5 mikrolitre C ve 500 mikrolitre PC'yi karıştırın. Daha sonra homojen bir yüzey tabakası verim için karışımı kurutmak için tüp içinde azot gazı kızarma sırasında cam tüp döndürün. 0.5 mililitrelik bir reaksiyon tüpünde, tampon A.Then 100 mikrolitre 100 mikrolitre sentetik mikroRNA ile 100 mikrolitre spermin çözeltisi ile iki mililitrelik reaksiyon tüpünde taze 30 milimolar spermin çözeltisi hazırlayın.
Ve 30 derece santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya yat. Daha sonra, hazırlanan PC-CO-C mastermix yüzey tabakasını yeniden sulamak için kuluçkaya yatan 200 mikrolitrelik çözeltiyi cam tüpe aktarın. Ve sonra mililitre sodyum deoksiol çözeltisi başına 30 miligram 50 mikrolitre ekleyin.
İki saat boyunca dört derecede karıştırın. Bundan sonra, cam tüp içine delipidated HDL çözeltisi 250 mikrolitre ekleyin. Ve bir gecede 4 derece karıştırın.
Diyalize başlamak için, ilk çift distile su 800 mililitre adsorbent boncuk 50 gram ekleyin. Ve bir dakika karıştırmak için manyetik karıştırıcı kullanın. Boncukların yerleşmesi için 15 dakika bekleyin ve süpernatant'ı dekantlayın.
İşlemi önceden soğutulmuş PBS ile tekrarlayın. PBS'de ıslak öncesi diyaliz kasetleri. Üreticinin talimatlarına göre kasetlere önceden hazırlanmış karışımı eklemek için bir şırınga kullanın.
PBS tarafından işlenmiş adsorbent boncukları üç litre PBS'ye ekleyin ve kasetleri PBS'ye yerleştirerek dört santigrat derecede diyalize alın. Boncuklar diyaliz membranı boyunca yoğunluk gradyanı sabit tutar. Bir saat ve iki saat sonra arabellek ve boncuk değiştirin.
24 saat sonra, bir şırınga ile, yeniden oluşturulan HDL parçacık çözeltisini kurtarmak için kasetteki çözeltiyi 1,5 mililitrelik bir reaksiyon tüpüne alın. Bradford tsay kullanarak protein konsantrasyonu belirleyin. Reaksiyon tüpüne inert gaz tedarik edin, kapatın ve yeniden oluşturulmuş HDL parçacık çözeltisini durağan gaz atmosferinin altında dört santigrat derecede saklayın.
İlk olarak, RNAse içermeyen suda taze 30 milimolar spermin çözeltisi hazırlayın. 100 mikrolitre sentetik mikroRNA 100 mikrolitre spermin çözeltisi ile iki mililitrelik reaksiyon tüpünde karıştırın. Ve 30 derece santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya yat.
Daha sonra hazırlanan mikroRNA spermin çözeltisine 100 mikrolitre DMSO ve 1,2 mililitre 1X LDL tampon ekleyin. PBS ile daha önce hazırlanmış LDL parçacık çözeltisini mililitrebaşına yaklaşık dört miligramlık bir konsantrasyona seyreltin. Daha sonra seyreltilmiş çözeltinin 450 mikrolitresini 1,5 mililitrelik bir reaksiyon tüpüne çekin ve 50 mikrolitre 10X LDL tamponile karıştırın.
Buzda 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, 500 mikrolitreLDL parçacık çözeltisi ve 1.5 mililitrelik mikroRNA-spermin-DMSO çözeltisini birleştirin ve 40 santigrat derecede iki saat kuluçkaya yatırın. Daha önce açıklandığı gibi diyaliz gerçekleştirin ve etiketli LDL parçacık çözeltisini durağan gaz atmosferinin altında dört santigrat derecede saklayın.
Başlamak için, PBS'deki HDL veya LDL parçacık çözeltisini 1'den 100'e 1'e 000 arasında seyreltin. Mika alt tabakasına yapıştırıcı bant basarak ve üst mika katmanlarını çıkarmak için bandı çekerek mikayı ayırın. Beş dakika kuluçka için taze yarık mika üzerinde iki mikrolitre yatırmak için bir pipet kullanın.
Lipoprotein parçacıkları yüzeylerde sürekli bağ membranları oluşturma eğilimindedir. Sonuç olarak, mika yüzeyindeki parçacık konsantrasyonunu tek tek ayarlamak önemlidir. Kuluçkadan sonra, örneği PBS ile durula.
Yüksek hızlı AFM sıvı hücresini PBS ile doldurun ve mika taşıyan tarayıcıyı yüksek hızlı AFM aşamasına monte edin. Kontrol yazılımında, mika yüzeyine cantilever yaklaşma sürecini başlatın. Bir metre kareden daha az ölçüm boyutları kullanın ve görüntüleme kuvvetlerini mümkün olduğunca düşük tutun.
Dokunma modunda örneği görüntüleyin. Verileri Gwyddion'a yükleyin ve parçacıkları eşik işlevine göre işaret taneleri aracılığıyla algıla. Tek tek parçacıkları maskelemek için yükseklik eşik değerini ayarlayın.
Genellikle, % 50 civarında bir seviye iyi bir başlangıç noktasıdır. Görüntüyü düzleştirmek için çok nolualt arka planı kaldırın ve maskeli bölge seçeneğini dışla seçeneğini etkinleştirin. Çeşitli tane karakteristiklerinin dağılımı işlevini kullanarak algılanan parçacıkların maksimum yükseklik değerlerini dışa aktarın ve kaydedilen tüm görüntüler için bu adımları yineleyin.
Bu deneyde HDL partiküllerinin yeniden yapılandırılması HDL partiküllerinin delipidasyonu ile gerçekleştirildi, ardından relipidasyon ve diyaliz yapıldı. Yeniden oluşturulan HDL partiküllerinin %50'si verim elde edilebilir. Ancak, apolipoprotein B100 proteininin hidrofobikliği nedeniyle, mikroRNA ile aynı etiketleme LDL partiküllerinin etiketlanması için mümkün değildi.
Böylece, DMSO LDL parçacıklarının lipid monotabakasının penetrasyonu için kullanılmıştır, kalite kontrolü sırasında %100'e yakın bir verim ile seyreltme analiz için kritiköneme sahiptir. Üstteki görüntü çok yüksek parçacık yoğunluğu gösterir. Alttaki görüntü analiz için uygundur.
Parçacık yüksekliklerinin olasılık yoğunluğu fonksiyonları yerli, etiketli ve etiketli kontrol lipoprotein parçacıklarının boyut dağılımlarının karşılaştırılması için hesaplanmıştır. Etiketleme işleminden önce ve sonra göreli değişiklik ihmal edilebilir. RNA oligonükleotidleri işlerken RNAse'siz çalışın.
Taze tek kullanımlık plastik sarf malzemeleri kullanın ve her zaman eldiven giyin. Sadece nükleaz içermeyen çözeltiler kullanın. Yüksek hızlı AFM lipoproteinlerin genel şeklini belirlemek için sadece bir yöntemdir.
Alternatif bir yöntem elektron mikroskobu olacaktır. Uygun kişisel koruma ekipmanı giyin ve diethyl eter kullanırken bir duman kaputunda çalışın.
