Как бластоцист биопсии и витрификации были революцией в ЭКО, экстракорпоральное оплодотворение, что позволяет эмбриологов со всего мира для выполнения предимплантации генетического тестирования на человеческие эмбрионы с минимальным риском для эмбриона. Trophectoderm биопсии позволило извлечения около семи клеток из полностью выращенного эмбриона, тем самым позволяя надежный вниз по течению генетического анализа. Кроме того, до настоящего времени не было показано никакого воздействия на этот подход.
Клиническая эффективность этого рабочего процесса позволяет пациентам с моногенными состояниями и всем пациентам с повышенным риском хромосомных аномалий в пределах их бластоцист извлечь выгоду из предимплантационного генетического тестирования. По-прежнему имеются возможности для совершенствования нынешних стратегий отбора эмбрионов. Например, miRNomic и протеомное профилирование представляют интригующие варианты в дополнение к предимплантации генетического тестирования на одной биопсии trophectoderm.
Неопытные операторы часто борются с открытием и проникновением zona pellucida. Это просто вопрос фокусировки. Бластоцист, лазерная цель и пипетки должны быть на одной координационной плоскости.
После маркировки биопсии блюдо с деталями пациента, с постоянным, нетоксичным маркером, число каждого 10-микролитровая капля HEPES-буферной среды с эмбрионом и цикл ID.Using 300-микрометр зачистки пипетки, передача жизнеспособной, полностью расширенный бластоцист к первой капле биопсии блюдо и промыть каплю, чтобы удалить избыток культуры среды, прежде чем двигаться. Поместите блюдо под перевернутый микроскоп, и премьер биопсии пипетки со средним от третьей капли биопсии блюдо. Под 20-кратное увеличение, сориентировать бластоцист, чтобы получить четкое представление о внутренней массе клетки в семь часов, и обеспечить эмбрион на проведение пипетки.
Сосредоточьтесь на zona pellucida так, чтобы и пипетки, и бластоцист были на одной координационной плоскости. Переключитесь на лазерную цель и распояйте лазерную указку на zona pellucida на противоположной стороне внутренней клеточной массы. Просверлите zona pellucida с двумя-тремя лазерными импульсами, и осторожно нажмите биопсии пипетки против zona pellucida, чтобы среда будет взорван через нарушение, чтобы отделить трофиктодерм клетки от внутренней поверхности.
Когда trophectoderm отделяется, введите через отверстие и аспирировать от семи до восьми trophectoderm клеток в биопсии пипетки с нежным всасывания. При применении умеренного всасывания растянуть целевые клетки, слегка переместить биопсии пипетки назад и направить лазер к тонкой части аспирированных клеток. Огонь от двух до пяти лазерных импульсов на стыках между клетками, чтобы отделить клетки-мишени от тела эмбриона.
Когда фрагмент трофиктодерма был отделен от бластоциста, отпустите фрагмент в ту же каплю биопсии далеко от бластоциста, чтобы предотвратить втягиваемый фрагмент обратно в пипету биопсии. Освободите бластоцист от удерживаемой пипетки и быстро поднимите обе пипетки, чтобы фрагмент не прилип к пипетки. Затем изображение биопсии фрагмента для целей контроля качества.
Когда все бластоцисты были биопсии, как только что продемонстрировано, переместить биопсии блюдо обратно в ламинарный капюшон потока и этикетки после биопсии культуры блюдо с парой ID и каждая капля с эмбрионом и цикл идентификаторов. В присутствии свидетеля, промыть бластоцист в чистой среде ЭКО и переместить бластоцист к его соответствующей капли в после биопсии блюдо. Затем поместите после биопсии блюдо на 37 градусов по Цельсию, 6%углекислого газа, и 5%кислородный инкубатор.
В присутствии свидетеля и внутри капота ламинарного потока при комнатной температуре, этикетка ПЦР трубки с постоянным, нетоксичным маркером. Этикетка крышку 60 х 15-миллиметровый трубки культуры блюдо с биопсией эмбриона IDs, и добавить две 10-микролитровые капли биопсии стиральный раствор к блюду. Премьер 140-микрометровый зачистки пипетки с биопсией стиральный раствор от второй капли трубки блюдо под стерео микроскопом, чтобы визуализировать фрагменты trophectoderm.
Аккуратно отпустите некоторые биопсии стиральный раствор на фрагмент trophectoderm, и загрузить фрагмент в зачистки пипетки. Переместите фрагмент на вторую каплю раствора для мытья биопсии и тщательно промойте ткань два-три раза. Перенесите фрагмент трофиктодерма на дно соответствующе помеченной ПЦР трубки с погрузочным раствором, заботясь о том, чтобы не касаться стенок трубки кончиком зачистки пипетки.
Когда все фрагменты были добавлены в их трубы, спина все трубы в мини-центрифуги в течение нескольких секунд, чтобы осадок фрагментов. Затем храните образцы при температуре минус 20 градусов по Цельсию, пока они не будут отправлены в ссылаясь генетической лаборатории для тестирования. В течение 30 минут после биопсии трофиктодерма, этикетка витрификации пластины с деталями пациента и IDs бластоцист, которые должны быть vitrified.
Используя специальные холодостойкие криолабели, маркировать витрификации поддерживает с именем пациента и фамилией, пара ID, ID эмбриона, который будет загружен на него, и дата процедуры. При комнатной температуре, обойтись 300 микролитров эквилибрации раствор для каждого бластоцист, который будет vitrified и, в присутствии свидетеля, использовать 300-микрометровый зачистки пипетки для перемещения бластоцист в один объем раствора эквилибрации. Оставьте бластоцист в растворе эквилибрации на 13-15 минут.
После первоначального сокращения объема будет наблюдаться постепенное повторное расширение. В конце эквилибрации добавьте 300 микролитров раствора витрификации на вторую колодец пластины витрификации и перенесите полностью повторно расширенный бластоцист в раствор витрификации на одну минуту. В конце инкубации, промыть бластоцист, чтобы разбавить раствор эквилибрации и, в присутствии свидетеля, загрузить бластоцист на витрификации поддержки.
Удалите избыток раствора витрификации. Тонкая пленка раствора должна окружать бластоцист. Окунитесь в поддержку витрификации в жидкий азот, и энергично перемещать поддержку, чтобы уменьшить риск образования пузырьков близко к образцу.
Затем поместите защитную крышку на опору, в то время как поддержка витрификации все еще погружена в жидкий азот. Из 1 544 процедуры биопсии трофиктодерма, проведенные в течение этого репрезентативного двухгородного периода, от одного до четырех бластоцист были биопсизированы за процедуру в течение от трех до 22 минут за процедуру. На этих участках показаны средние сроки биопсии для каждого оператора вдоль триместров исследования, со средним общим значением 8,24 минут.
Полезно получить изображение каждого биопсии фрагмента для целей контроля качества, чтобы оценить, была ли причина безрезультатных диагнозов вменяемой размеру и/или качеству фрагмента, тюбингу или некоторым проблемам в обработке образца в генетической лаборатории. В этом исследовании, 572 эуплоидных бластоцистов были подогреты, чтобы пройти перенос эмбриона после диагноза эвплоидии. Все бластоцисты vitrified в течение 30 минут, с 2,4% бластоцист не повторно расширяется между 31 и 90 минут и 4,9%не повторно расширяется за 90 минут от повторного овеяния.
Особенно для низкого качества и / или день семь бластоцист, сроки между биопсией и витрификации кажется решающим для достижения повторного расширения после потепления. Позаботьтесь, чтобы сосредоточиться перед открытием zona pellucida при разоблачении соединения между клеткой trophectoderm и стрельбы, и заботиться также, чтобы предотвратить бластоцист повторного расширения до витрификации. Существуют два других подхода к биопсии бластоциста, которые влечет за собой открытие zona pellucida и ожидание спонтанного выгиба клеток трофиктодерма.
Эти подходы проще, но требуют больше манипуляций и ото дня. Эффективность этого рабочего процесса позволяет внедрение молекулярных технологий в ЭКО, чтобы попытаться выбрать бластоцист с наибольшим шансом имплантировать перед переносом эмбриона. Помните, что не использовать любое устройство или решение, которое может быть токсичным для эмбрионов и для предотвращения загрязнения ДНК с помощью материалов, свободных от ДНК.
