Многие беременности терпят неудачу на ранних стадиях развития эмбрионов человека в течение семи или восьми после оплодотворения. Этот протокол предоставляет возможность следователям выращивать человеческих концептуаров в пробирке во время этого таинственного окна имплантации. Это позволяет нам понять механизмы, которые лежат в основе успеха имплантации человека и раннего плацентарного образования.
Использование расширенной системы культуры для выращивания пери-имплантации стадии человеческих эмбрионов in vitro, вероятно, единственный способ получить подлинные материалы для изучения имплантации и ранней дифференциации трофибласта. Этот простой метод является мощным инструментом, который позволяет нам ответить на многие фундаментальные вопросы о раннем развитии человека. Исследования, проведенные с использованием этого протокола, в значительной степени будут способствовать пониманию ранней потери беременности, рецидивирующей неудачи имплантации и патологий плаценты.
Демонстрацией процедуры будет Deirdre Logsdon, аспирант из лаборатории. За день до потепления эмбриона, подготовить средства массовой информации и восстановления пластин в стерильной ламинарный капюшон потока. Заполните два центра хорошо орган культуры мыть посуду с 500 микролитров БМ с 10%SPS, а затем покрыть БМ с 500 микролитров эмбриона культуры класса нефти.
В 16-миллиметровой ткани культуры блюдо, слой восемь миллилитров эмбриона культуры нефти и якорь 20 микролитровых капель БМ с 10%SPS на дно. Эквилибрировать мыть посуду и восстановление пластины в инкубаторе при 37 градусов по Цельсию, 6%углекислого газа и 5%кислорода, по крайней мере четыре часа. Aliquot примерно четыре миллилитров IVC 1 в пять миллилитров оснастки крышка трубки и подготовить одну тарелку мыть с 500 микролитров IVC 1 без масла наложения.
Эквилибрировать блюдо и трубку в инкубаторе, по крайней мере четыре часа. Разбавить фибронектин из человеческой сыворотки в PBS до 30 микрограмм на миллилитр. Откройте восемь хорошо камерных coverslip пакет заботясь, чтобы не прикасаться к скважинам, а затем осторожно пипетки 250 микролитров фибронектина в каждой скважине.
Замените крышку на крышке и инкубировать его при четырех градусах по Цельсию в течение 20 до 24 часов. Подготовка расширенной пластины культуры на утро потепления эмбриона. Извлеките камерную крышку скольжения с фибронектином и поместите его в капот ламинарного потока.
Затем удалите фибронектин смесь с одним миллилитров пипетки и выбросить его. Pipette 300 микролитров equilibrated IVC 1 в каждую колодец и поместите крышку в инкубатор до удаления zona pellucida. После потепления и восстановления человеческих эмбрионов D5, оценить их для повторного расширения и сфотографировать каждый эмбрион.
Перемести каждый эмбрион на 500 микролитров буферной среды обработки MOPS с 5%FCS. Затем обработать его кислым раствором Тирода, как описано в рукописи текста. Немедленно переместите эмбрион с растворяемой зоной в 300 микролитров разогретой MOPS буферной среды, чтобы утолить раствор Тирода.
Затем переместите эмбрион в центральную тарелку ткани органов, содержащую уравновешенный БМ с 10%SPS под маслом класса культуры эмбриона. Затем верните эмбрион к падению восстановления 20 микролитров. Индивидуально переместите эмбрионы в мытье тарелки с equilibrated IVC 1 средств массовой информации, а затем тщательно переместить каждый эмбрион в колодец камерной крышки, убедившись, что отслеживать идентификацию эмбриона.
Верните камерный крышку в инкубатор, установленный до 37 градусов по Цельсию, 6%углекислого газа и атмосферного кислорода в течение двух дней. На второй день, внимательно изучить вложение эмбрионов под микроскопом и обмена средствами массовой информации. Знайте, какой эмбрион прилагается к блюду, осторожно нажав на тарелку.
Чтобы изменить средства массовой информации, снимите крышку и тщательно аспирировать 150 микролитров IVC 1, заботясь, чтобы не беспокоить прикрепленный эмбрион. Если эмбрион еще не прикреплен к пластине, не обмениваться средствами массовой информации, потому что сыворотка в IVC 1 поможет в вложении. Медленно пипетки 150 микролитров equilibrated расширенной культуры средств массовой информации, IVC 2 в каждой хорошо и заменить крышку на обложке.
Аккуратно вернули камерные крышки в инкубатор. Повторяйте обмен мультимедиа и проверку вложений каждый день, пока эмбрионы не будут готовы к фиксации или одноклеточному пищеварению. Если сбор оттраченных средств массовой информации необходим для дальнейшего анализа, заморозить 150 микролитров удаленных IVC 1 в стерильной низкой связывают 0,5 миллилитров трубки.
Вымойте каждый эмбрион один раз с 200 микролитров PBS, а затем добавить 200 микролитров трипсина решение каждой хорошо. Верните камерную крышку в инкубатор на пять минут. Используйте небольшую пипетку или мелко вытащил рот пипетку, чтобы забрать отдельные MTB затем использовать большую пипетку, чтобы мягко разобщить эмбрион, аспирируя вверх и вниз.
Продолжить аспирации эмбриона мягко и неоднократно с помощью меньшего диаметра пипетки отзыв, пока эмбрион был инкубирован в общей сложности 10 минут в трипсин. Для выполнения одного выбора клеток, переместить диссоциированные клетки через 320 микролитер мыть капли PBS и 0,1%PVP под эмбрион культуры нефти, заботясь, чтобы не потерять любые клетки. После мытья клетки используют мелко вытащил стеклянную пипетку, чтобы выбрать одну клетку.
Тщательно пипетка одной клетки в стерильные 0,2 миллилитров низкой связывания трубки с минимальным объемом PBS и PVP. Прикрепте свободные одиночные клетки в жидком азоте и храните их на отрицательных 80 градусах Celsius для более дальнейшего использования. Здоровые эмбрионы проявляли продолжающееся распространение в течение расширенной культуры, в то время как ненормальные эмбрионы начали оттягиваться от внешних краев и распадаться.
На восьмой день после оплодотворения большинство клеток эмбрионов были цитотрофобластом или КТБ, которые были положительными для трофибластного маркера GATA-3. На периферии эмбриона, CTBs уже дифференциации в многонуклеатических синцитотрофобластов, которые были лист, как внешний вид и окрашенных положительные для человека CGB. На 10-й день формирование положительной миграционной трофибластной клетки ЦБ было на максимуме, что было подтверждено всплеском производства ГХГ в это время.
Мигрирующие трофибласты, которые окрашены положительным для HLA-G, также начали появляться и мигрировать от тела эмбриона. К 12-му дню дифференциация СТБ была в упадке, и производство МТБ стало более заметным, что свидетельствует о смене акцента с производства гормонов на 10-й день на миграцию клеток на 12-й день. Эти изменения можно наблюдать в замедленном видео пери-имплантации периода.
Видео демонстрирует коллапс бластоцеле, образование СТБ, а также возможную дифференциацию и миграцию МТБ. Самое главное, что нужно иметь в виду при завершении этой процедуры является то, что вы работаете с живыми эмбрионами, которые чувствительны к изменениям температуры, осмолальности и рН. Минимизация количества времени, в течение которого блюда находятся вне инкубатора, имеет решающее значение для поддержания здоровья эмбриона.
После завершения этой процедуры, исследователи могут использовать изолированные одиночные клетки для вниз по течению одноклеточных омиков анализы, такие как одноклеточная РНК секвенирования и всего генома бисульфита секвенирования, чтобы лучше понять эпигенетические и транскриптомные изменения во время имплантации человека и раннего образования плаценты.
