Этот анализ in vitro демонстрирует ангиогенное прорастание в высокой пропускной способности и масштабируемой платформе. Это может быть использовано для поиск новых целей в ангиогенезе. Этот анализ ангиогенеза сочетает в себе сложные клеточные микросреду, которая включает градиенты и перфузию, с платформой, совместимой с высоким уровнем пропускной способности.
Ангиогенез играет важную роль как в здоровье, так и в болезни. Понимание механизмов, которые происходят во время ангиогенеза может помочь нам понять, как рак растет и как ткани ремонт. Этот метод может дать представление о механизмах при сердечно-сосудистых заболеваниях и регенерации тканей.
В обоих случаях ангиогенез играет важную роль. Для первого использования этой микрофлюидной платформы, вы должны быть осведомлены о законе объемов и как пипетки. Вы можете подтвердить шаги, глядя под микроскопом или листать пластину вверх дном.
Некоторые шаги трудно почувствовать, когда просто чтение метода, например, как малы микрофлюидные каналы или как держать пластину. Демонстрацией этих процедур будет Венди Стэм, техник из нашей лаборатории. Для начала перенесите микрофлюдиковую пластину 384-колодец в стерильный ламинарный капюшон потока.
Снимите крышку и добавьте 50 микролитров воды или фосфатного буферного солевого раствора к каждой из 40 наблюдательных скважин с помощью многоканарной пипетки. Затем добавьте 1,5 микролитра по четыре миллиграмма на миллилитр коллагена один раствор в гель вход каждого микрофлюидного блока. Убедитесь, что капля геля помещается в середине каждого хорошо для того, чтобы гель, чтобы войти в канал.
После заполнения пяти микрофлюидных блоков переверните пластину вверх дном, чтобы визуально проверить правильное заполнение гелеобразных каналов. Поместите микрофлюдичную пластину в инкубатор при 37 градусах цельсия и 5%углекислом газе в течение 10 минут для полимеризации коллагена. Затем вынюхив тарелку из инкубатора и перенесите в стерильный ламинарный капюшон.
Добавьте 50 микролитров по 10 микрограмм на миллилитр фибронектина, кодирующих раствор, к выходу хорошо верхнего перфузионого канала каждого микрофлюидного блока. Нажмите наконечник пипетки на стороне хорошо для правильного заполнения хорошо, не захватывая пузырьки воздуха. Канал заполняется и жидкие кастрюли на выходе без заполнения розетки хорошо.
Затем поместите тарелку в инкубатор, по крайней мере два дня. Теперь, быстро разморозить замороженных IPSC-ECs менее чем за одну минуту в 37 градусов по Цельсию водяной бане. Затем перенесите клетки в 15 миллилитровую трубку и медленно добавьте 10 миллилитров базальной среды, чтобы разбавить.
Нарисуйте 10 микролитров раствора и посчитайте клетки на клеточном счетчике. Центрифуга трубки при 100 раз г в течение пяти минут. Аспирировать супернатант, не нарушая гранулы клетки и повторно использовать в базальной среде, чтобы дать концентрацию в два раза от 10 до седьмого клетки на миллилитр.
Затем перенесите микрофлюидную пластину 384-колодец из инкубатора в стерильный ламинарный капюшон. Аспирировать раствор кодирования фибронектина из перфузионной розетки и добавить 25 микролитров базальной среды в выходных скважинах. Добавьте одну каплю микролитров клеточной подвески к каждому верхнему входу перфузии хорошо.
Капля выравнивается в течение нескольких секунд. Проверьте под микроскопом, является ли посев однородным в пределах одного канала и между каналами. Инкубировать микрофлюидной пластины хорошо в течение одного до 1,5 часов при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа.
После этого проверьте ячейки, чтобы подтвердить, что они придерживались. Удалите базально-базиальную среду из верхних перфузионных выходных скважин. Добавьте теплую культуру сосудов в верхний вход и розетку перфузии.
Поместите пластину на рокер платформу, которая установлена на семи градусов угол и восемь минут качания интервал в инкубаторе. В первый и два дня после посева, изображение пластины с помощью микроскопа Brightfield с автоматизированной стадии для подтверждения жизнеспособности клеток. Через два дня, слияние монослой сформировался против коллагена один эшафот.
Во-первых, подготовить 4,5 миллилитров ангиогенной прорастания среды путем дополнения 4,5 миллилитров базальной среды с 4,5 микролитров акций VEGF, 4,5 микролитров запасов PMA и 2,25 микролитров запасов S1P. Приготовьте 8,5 миллилитров среды роста сосудов, дополнив базальную среду 5,1 микролитров VEGF и 3,4 микролитров BFGF. Аспират среды из скважин и добавить 50 микролитров свежего сосуда культуры среды в верхней перфузии вход и выход скважин и гель вход и выход скважин.
Затем добавьте 50 микролитров ангиогенной смеси ростков к каждому из входных и выходных скважин нижнего перфузионого канала. Поместите пластину обратно в инкубатор на рокерской платформе, чтобы сформировать градиент ангиогенных факторов роста. Через день и два дня после добавления ангиогенных факторов роста используйте микроскоп Brightfield для изображения скважин на автоматизированной сцене.
Для изучения анастомоза и стабилизации ростков добавьте один микролитр 0,5 миллиграмма на миллилитр флуоресцентно помеченного альбумин в верхний вход перфузии. Затем смешайте раствор с 50 микролитровой пипеткой. Перенесите пластину на флуоресцентный микроскоп с автоматической стадией и инкубатором, установленных при 37 градусах Цельсия.
Установите микроскоп на цель 10X и исправить настройки экспозиции. Приобретайте изображения таймлапса каждую минуту в течение 10 минут. Снимите пластину с микроскопа и перенесите пластину в стерильный ламинарный капюшон.
Удалите всю среду из скважин и замените как сосудную культуру средней, так и ангиогенной прорастания среды в соответствующих скважинах. Поместите микрофлюидную пластину обратно в инкубатор, чтобы продолжить ангиогенное прорастание. На шестой день повторите визуализацию, чтобы изучить проницаемость.
Чтобы исправить клеточной культуры, аспирировать все культурные средства массовой информации из колодцев. Добавьте 25 микролитров 4%PFA в PBS ко всем перфузионизным входным и розеткным скважинам. Затем поместите одну сторону микрофлюидной пластины на крышку под небольшим углом в пять градусов, чтобы вызвать поток.
Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре. После этого, аспирировать PFA из скважин. Вымойте все заливки перфузии и розетки дважды с 50 микролитров HBSS.
Затем аспирировать HBSS из скважин. Параформальдегид является опасным химическим веществом, которое должно быть обработано в перчатках и открыто только в дымовом капюшоне. Далее добавьте 50 микролитров 0,2% неионных сурфактантов ко всем перфузионных входов и выходов для проницаемости при комнатной температуре в течение 10 минут и поместите микрофлюидную пластину на крышку под небольшим углом в пять градусов.
Аспирировать неионные сурфактант из скважин и мыть перфузионных каналов в два раза, добавив 50 микролитров HBSS для всех перфузионных входных и выходных скважин. Аспирировать HBSS из скважин. Подготовка Hoechst 1000 до 2000 для окрашивания ядер и подготовить фаллоидин от 100 до 200 в HBSS для окрашивания F-актина.
Объедините шесть миллилитров HBSS, 30 микролитров F-актина и три микролитров Hoechst в трубке Falcon. Затем добавьте 25 микролитров к каждому входу перфузии и розетке хорошо. Поместите пластину под небольшим углом и инкубировать при комнатной температуре, по крайней мере 30 минут.
Вымойте дважды с 50 микролитров HBSS во всех перфузии входов и розеток. Затем непосредственное изображение с помощью флуоресцентного микроскопа с автоматизированной стадией или хранить пластину защищенную от света при четырех градусах по Цельсию для более длительного использования. В этом протоколе микро-сосуды постоянно пронизылись и подвергались воздействию градиента ангиогенных факторов роста.
Посев IPSC-ECs с использованием метода пассивной накачки привел к однородной плотности посева. Timelapse капли, которая помещается на верхней части входе микрофлюидного канала показывает каплю сразу после добавления, капля на верхней части ствола входе после добавления, пока капля мениска был закреплен вход, который привел к потоку к розетке. Воздействие градиента ангиогенных факторов привело к направленной ангиогенной прорастания микро сосудов в узорчатом коллагене одним гелем.
Ясное образование кончиков клеток и вторжение в коллаген один гель был виден через 24 часа после добавления ангиогенного градиента в то время как фондовые клетки, включая образование люмена были видны после 48 часов. После фиксации и окрашивания, форма и длина этих ростков были определены. Однако, без добавления факторов роста, никакого вторжения в коллаген один гель не наблюдалось.
С помощью конфокальных изображений был определен диаметр ростка и подтверждено образование люмена. Этот метод может быть использован для проверки новых ангиогенных ингибиторов. Это может помочь найти новые методы лечения диабетической ретинопатии, ревматоидного артрита и рака.
В настоящее время мы изучаем, как мы можем создать со-культуры, включая модель гемового барьера и васкуляризированных органоидов.
