Наш протокол предоставляет новый инструмент для оценки ангиогенного потенциала связанных с опухолью первичных нейтрофилов in vivo без необходимости использования искусственных моделей линии нейтрофиловых клеток. Прямое ингибирование никотинамида фосфорибозилтрансферазы, вскоре NAMPT, в опухолевых нейтрофилов с их последующей приемной передачи в опухоленосных животных позволяет манипуляции нейтрофилов без системных токсических побочных эффектов. Мы продемонстрируем терапевтический потенциал манипулируемых антиангиогенных опухолевых нейтрофилов после переноса в опухолевые хосты для изучения потенциальных иммунотерапии на основе нейтрофилов в различных моделях рака.
Чтобы создать алогенную модель опухолевой мыши, побрить кожу от 10 восьми до 12-недельной самки интерферона альфа и бета-рецептор субъединит 1 нокаут мышей с электрической бритвой и дезинфицировать кожу с 70%этанола, затем загрузите три раза 10 до шести клеток меланомы B16F10 на миллилитр PBS в одномиллилитровом шприце, оснащенном иглой 0,4 на 19 миллиметров, и ввилит 100 микролитров подвески подкожно на заднем фланге в каждый бритый Животных. Для нейтрофил-приемной передачи, разбавить B16F10 меланомы клетки в шесть раз от 10 до шестой клетки на миллилитр концентрации в PBS и разбавить нейтрофилов лечение ингибитором NAMPT FK866 в шесть раз от 10 до пятой клетки на миллилитр концентрации PBS. Затем смешайте необработанные или обработанные ингибиторами нейтрофилов с клетками меланомы в соотношении нейтрофил к опухоли 1:10 и подкожно ввилит 100 микролитров клеток в до пяти мышей в группу.
После инъекций поместите до пяти инъекционных самок мышей в одну клетку и используйте калиперы для измерения длины, ширины и глубины опухоли каждый день в течение 14 дней. На 14-й день после инъекции дезинфицировать кожу каждого инъекционного животного 70%этанолом и использовать ножницы и хлипки для сбора опухолей в 50-миллилитровую коническую трубку, содержащую полную среду на льду. Для раздела опухолей для гистологического анализа, погрузить опухоли в оптимальное соединение температуры резки и заморозить образцы в жидком азоте для хранения при температуре минус 80 градусов по Цельсию.
В день секции, оттепель образцов до минус 20 градусов по Цельсию, прежде чем использовать криотомию для получения пятимиметровых секций. После фиксации в неспецифических связывания, пятно опухолевых тканей разделов с первичными антителами интерес в течение одного часа при 20 градусов по Цельсию, а затем три моет в PBS. После последней стирки, пятно клеток с соответствующим флуоресценции конъюгированных вторичных антител в ядерном окрашивания красителя, как DAPI в течение одного часа при 20 градусах по Цельсию защищены от света.
В конце инкубации высушите горки в течение 20 минут при 20 градусах Цельсия, защищенных от света, прежде чем монтирование образцов с помощью ангидроус-монтажной среды, затем накройте каждый слайд крышкой скольжения и дайте монтажной среде высохнуть в течение одного часа при 37 градусах по Цельсию, прежде чем изображения тканей с помощью микроскопии флуоресценции. Для опухолевой изоляции нейтрофилов поместите пять опухолей на скважину в отдельные колодцы стерильной шестиясной пластины, поскольку они собирают, и используйте стерильные ножницы, чтобы измельчить опухоли на две-три миллиметра. Далее, переварить фрагменты опухоли с одним миллилитром диспас коллагеназы d dnase 1 раствор в течение 45 минут при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислого газа с влажностью, смешивая образцы с 10-миллилитровым шприцем каждые 15 минут.
В конце инкубации, фильтровать клетки через 100-микрометровые ситечко в одну 15-миллилитровую трубку на колодец, чтобы удалить непереваренные волокна и добавить PBS к окончательному объему 15 миллилитров. Соберите диссоциированные клетки путем центрифугации и подлизать красные кровяные тельца с одним миллилитром буфера лиза на трубку. После смешивания смешайте содержимое каждой трубки в одну 15-миллилитровую трубку, остановив реакцию через две минуты с 11 миллилитров полной четырехградсовой среды цельсия.
После центрифугации, повторное использование гранул в один миллилитр PBS и блокировать любые неспецифические связывания с тремя микролитров fc-блока антитела в течение 15 минут на льду. В конце инкубации, этикетки клеток с анти-CD11b и Ly6G антител и любые другие антитела, представляющие интерес, а также DAPI, для 30-минутной инкубации на льду защищены от света. В конце инкубации, мыть клетки в 14 миллилитров PBS и повторно гранулы в один раз от 10 до седьмой клетки на миллилитр свежей полной средней концентрации на льду, затем сортировать CD11b-положительный, Ly6G, высокие DAPI-отрицательные нейтрофилов на флуоресценции активированных клеток сортера в соответствии со стандартными протоколами сортировки, проверяя чистоту изолированных нейтрофилов на цитометре потока в конце рода.
Для ингибирования нейтрофилов, связанных с опухолью in vitro, семя 1,5 раза от 10 до пятого отсортированного нейтрофилов в каждую из двух скважин 96-хорошо U-нижней пластины и добавить FK866 к окончательной концентрации 100 наномолярных в полной среде в один колодец и равный объем полной среды только для другой скважины. После двух часов в инкубаторе клеточной культуры, мыть клетки два раза с PBS и повторно гранулы в PBS при соответствующей концентрации для последующей инъекции. NAMPT-ингибитор обработанных нейтрофилов имеют значительно сниженную способность стимулировать образование аорты ветви по сравнению с необработанными клетками.
Кроме того, подкожная инъекция ингибитора обработанных антиангиогенных нейтрофилов вызывает значительное ухудшение роста опухоли по сравнению с мышами, введенными с необработанными интерферон альфа и бета-рецептор субъединица 1 нокаут нейтрофилов. Гистологическое исследование извлеченных опухолей еще раз подтверждает значительное подавление ангиогенеза в опухолях, изолированных от мышей, обработанных ингибиторами связанных с опухолью нейтрофилов по сравнению с теми, которые вводятся с необработанными нейтрофилами нокаута. Для оценки свойств FK866-обработанных опухолевых нейтрофилов, количественных ПЦР и Западной пятно может быть выполнено для изучения активации внутриклеточных путей, участвующих в нейтрофиловой поляризации.
Поскольку нейтрофилов недолговечны, необходимо выполнить все шаги как можно быстрее и сохранить нейтрофилов холодными в течение всей процедуры. Этот метод прокладывает путь для изучения внутриклеточных механизмов и факторов, участвующих в регуляции ангиогенных и опухолевых свойств опухолевых нейтрофилов in vivo.
