Этот метод пытается описать три часто используемых метода оценки миграции нормальных нейтрофилов in vivo и in vitro, а также инфильтрации патологических нейтрофилов в модели мышиного артрита. Мы считаем, что этот метод может быть полезен для других исследователей в этой области. Этот протокол содержит методологические детали для оценки миграционной способности нейтрофилов в местах воспаления с помощью анализа воздушного мешка и адъювантного артрита.
Последствия этого метода распространяются на артрит терапии, сравнивая модель группы с группой лечения. Этот метод может дать представление о воспалительных заболеваниях и может быть применен к воспалительным заболеваниям кишечника. Демонстрацией процедуры будут Циньи Лу и Хайсю Цзян, аспиранты из нашей лаборатории.
После обезболировки мышей на нулевом дне используйте фильтр 0,22 микрона, прикрепленный к пятими миллилитровому шприцу, чтобы получить трехми миллилитрный объем стерилизованного воздуха. Поднимите заднюю кожу обезболивающей мыши пинцетом и подкожно используйте 26 калибровочных 3/8 дюймовых игл для введения трех миллилитров стерилизованного воздуха. После лечения удалите мышей из дыхательного блока и поместите их в хорошо установленную клетку.
Мониторинг мышей, чтобы убедиться, что они живы, пока они не начинают двигаться вокруг. На третий день ввимит еще три миллилитров стерилизованного воздуха в ранее установленный воздушный карман для поддержания воздушного мешка. На шестой день ввимим различные процедуры в воздушный мешок.
Введать один миллилитр PBS в качестве отрицательного контроля и ввести один миллилитр одного микрограмма на миллилитр LPS в качестве положительного контроля, чтобы вызвать местное воспаление. Через шесть часов пожертвуй мышами. Для каждого воздушного мешка, ввимите один миллилитр буфера мытья для того чтобы помыть мешок воздуха и собрать воспалительный экссудат в пробке центрифуги 15 миллилитров.
Затем мыть воздушный мешок с двумя миллилитров мыть буфера в два раза и собирать воспалительные экссудата в той же центрифуге трубки. Центрифуга при 100 раз г в течение 10 минут при комнатной температуре. Отбросьте супернатант и повторно посовелите клетки в один миллилитр буфера стирки.
Подсчитайте клетки для количественной оценки соотношения нейтрофилов с помощью автоматического гематологического анализатора. Приостановить полный адъювант Фрейнд путем вихревого по крайней мере пять секунд, а затем привлечь 100 микролитров подвески в инжектор инсулина. После анестезии, отметь выбранную лапу и ввись 20 микролитров адъюванта полного Фрейнд от инжектора в четыре периартикулярных пятна на пространстве голеностопного сустава.
Поместите обработанных мышей в новую камеру. Мониторинг мышей, чтобы убедиться, что они дышат, пока они не восстановить способность двигаться. Каждые три дня используйте датчик толщины кармана для измерения диаметра голеностопного сустава.
Кроме того, оценить тяжесть артрита по критерию оценки артрита. Ноль - это нормально. Никаких признаков эритемы и отеков.
Один из них является самым мягким артритом. Эритема и легкий отек ограничивается tarsals или голеностопного сустава. Два - это умеренный артрит.
Эритема и легкий отек простирается от лодыжки до tarsals. Три - это тяжелый артрит. Эритема и умеренный отек, простирающийся от лодыжки до плюсневых суставов.
Четыре из них является самым тяжелым артритом. Эритема и сильный отек охватывают лодыжки, ноги и цифры, или анкилез конечности. Пожертвовав мышью, удалите кожу и часть мышцы с задней ноги с помощью пинцета и ножниц.
Спрей сустава с 70% этанола и удалить остальные мышцы с помощью бумажного полотенца. Исправить голеностопного сустава в 4%paraformaldehyde в течение двух дней при комнатной температуре. Затем decalcify сустава в 10%EDTA в течение одного месяца при комнатной температуре и изменить средний еженедельно.
Через месяц поместите ткань в маркированную форму с определенным объемом жидкого парафина при примерно 60 градусах по Цельсию, чтобы встроить ткань. Прохладный кратко. Установите толщину на микротоме на четыре микрометра и нарежьте ломтики.
Затем плавать разделы в 43 градусов по Цельсию водяной бане в течение короткого времени, чтобы расширить разделы. Нагрейте секции на слайдах и поставь горки в духовку при температуре 70 градусов по Цельсию в течение двух часов. Для дальнейшего использования, сохранить слайды при температуре минус 20 градусов по Цельсию.
Затем поместите горки в стойку и выполняем стирку в ксилене и этаноле в соответствии с рукописью для регидратации при комнатной температуре. Наконец, мыть в проточной водопроводной воде в течение трех минут. Затем пятно в 0,1%быстрый зеленый раствор в течение пяти минут.
Промыть 1%acetic кислоты в течение 10 секунд и пятно в 0,1%Safranin O окрашивания раствор в течение 20 минут. После этого погрузите горки в растворы для мытья ксилена и этанола в соответствии с рукописью. Намонтировать секции тканей на стадии объекта и наблюдать ткани под микроскопом.
Чтобы визуализировать нейтрофилов, выполните иммуногистохимическое окрашивание, сначала выпекая парафиновые секции в течение двух часов при 78 градусах по Цельсию. Поместите горки в стойку и выполните ксилен, этанол, воду и PBS моет в соответствии с рукописью для регидратации при комнатной температуре. Затем добавьте одну каплю буфера пермяки, чтобы покрыть ткань.
Инкубировать секции в подносе, контролируемом влажностью, при 37 градусах по Цельсию в течение 10 минут. После этого, промыть слайды в PBS в течение трех минут три раза. Избегайте полоскания ткани напрямую.
Далее выполните поиск антигенного эпитопа, вызванного теплом. Упорядочить слайды в стойке. Погрузите слайды в котел давления, наполненный буфером поиска.
Положите котел давления в микроволновую печь и установите микроволновую печь на 600 Вт и нагревать горки в течение 10 минут. После кипячения держите горки в котле, чтобы остыть до 90 градусов по Цельсию. Вынуть горки и промыть их в PBS в течение трех минут три раза.
Чтобы утолить эндогенную активность пероксидазы, погрузите горки в свежеприготовленные 3%перекиси водорода при комнатной температуре в течение 15 минут. Промыть слайды в PBS в течение трех минут три раза. Очертить большой круг вокруг образца с гидрофобной ручкой.
Избегайте прикосновения к образцу. Добавить в образец от 50 до 100 микролитров 3%бычьего альбумин сыворотки, чтобы заблокировать и поместить образцы в камеру, контролируемую влажностью при 37 градусах по Цельсию в течение 60 минут. Затем удалите блокирующий раствор.
Добавить 50 микролитров PBS разбавленных первичных антител к каждому разделу быстро. Инкубировать слайды в влажности контролируемых лоток при четырех градусах по Цельсию в одночасье. На второй день вынул лоток и дайте ему стоять при комнатной температуре в течение 30 минут.
Затем промыть горки в PBS в течение трех минут три раза. Добавьте 50 микролитров PBS разбавленных вторичных антител к тканям. Инкубировать слайды в подносе, контролируемом влажностью, при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут.
Затем промыть горки в PBS в течение трех минут три раза. Разработать в разбавленном растворе DAB в течение пяти минут. Избегайте развития темного цвета, вызванного чрезмерной реакцией DAB.
Промыть горки в дистиллированной воде. Counterstain слайды в гематоксилин в течение 10 секунд и промыть горки в водопроводной воде в течение пяти минут. Промыть кислотным спиртом супер быстрый раствор дифференциации в течение трех секунд, затем промыть в водопроводной воде в течение 10 минут.
Погрузите горки в этанол и ксилен моет при комнатной температуре в соответствии с рукописью. Исправить крышку с монтажом раствора. Наблюдайте за тканью под микроскопом.
В этом исследовании были проведены эксперименты с воздушными мешками для исследования набора нейтрофилов, стимулируемого LPS in vivo. Подмножества лейкоцитов в экссудах воздушного мешка были намного выше, чем в контроле. По сравнению с контрольной группой, адъювант-индуцированной группы артрита показали значительный отек в лапе.
Диаметр голеностопного сустава увеличился, и оценка артрита постоянно поднималась. Повреждение хряща является репрезентативным синдромом ревматоидного артрита. CFA задача индуцированных большое количество инфильтрации лейкоцитов, значительные эрозии хряща, и синовиальной гиперплазии.
MPO в любых уровнях выражения являются репрезентативными маркерами проникновения нейтрофилов, которые были значительно upregulated в совместном разделе. Убедитесь, что воздух вводится в кожу, но не в мышцу. Мы также можем исследовать формирование нейтрофилов внеклеточных ловушек путем иммуногистохимического окрашивания секций тканей голеностопного сустава с анти-p84 или Эти методы могут быть использованы для изучения других воспалительных заболеваний, таких как воспалительные заболевания кишечника.
