Этот протокол имеет важное значение, поскольку он может быть использован для допроса иммунного репертуара человеческих доноров для выявления редких, антиген-специфических В-клеток. Этот метод позволяет нам получить родные парные тяжелые и легкие цепи, которые могут быть быстро клонированы, а затем непосредственно протестированы против антигена или антигенов, представляющих интерес. Демонстрацией процедуры будет Майк Мортон, техник из нашей лаборатории.
По крайней мере, через час после оттаивания и восстановления, собирать донора PBMC путем центрифугации. И повторно приостановить клетки в 50 миллилитров ледяной МЕУ Буфер для подсчета. Пеллет клетки другой центрифугации, и изолировать CD22-положительных B-клеток путем положительного отбора с CD22 микробусов в соответствии со стандартными протоколами.
Соберите бисер изолированных CD22-положительных клеток центрифугации и повторного перерасхода клеток в четыре раза 10 до седьмой клетки на миллилитр концентрации буфера Vax. Добавьте коктейль антител IgG CD19 CD27 к клеткам согласно рекомендациям разбавления производителя с нежным смешиванием, и aliquot 10 к седьмым клеткам в трубку микроцентрифуга 1.5 миллилитров для отрицательного управления. Добавьте двухмаркированные биотиновые тетрапидиновые тетрамеры в отрицательную контрольную трубку при конечной концентрации 36 наномолярных каждый с PE и APC, умноженных на количество пептидов в сорте трубки.
Принесите окончательный объем в каждой трубке 2,5 миллилитров со свежим буфером Vax и добавить пептид тетрамеры в трубу рода на 36 наномолярных каждый PE и APC. После центрифугирования, довести клетки до двух раз от 10 до 6 на 100 микролитров концентрации TBS для 30 до 60 минут инкубации, в темноте, при четырех градусах по Цельсию, с вращением. В конце инкубации, мыть клетки два раза в свежем буфере TBS на стирку, прежде чем напрягать образцы в отдельные пять миллилитров фильтр-шапка труб.
Пятно образцов с 0,3 микромоляной конечной концентрации DAPI в качестве маркера целостности клеточной мембраны. И запустите весь отрицательный контроль на сортаторе клеток, чтобы установить ворота цитометрии потока для изоляции соответствующих популяций клеток для сортировки одной ячейки. Участок антиген PE против антигена APC и установить R8 ворота в качестве антигена PE-положительный, и APC-положительный квадрант с низким числом событий в двойных положительных ворот.
Затем сортируют один CD19-положительный CD27-положительный антиген PE-положительный, антиген APC-положительные клетки в отдельные скважины Master Mix подготовленных 96 пластины скважины. В конце сортировки накройте пластину алюминиевыми ленточных прокладками и центрифуга клетки в течение одной минуты при 400 раз г до хранения минус 80 градусов. Для выполнения обратной реакции транскриптазы, оттепель отсортированы B-клеток на льду в течение двух минут, прежде чем спиннинг пластины в течение двух минут при 3300 раз г тянуть содержимое хорошо в нижней части пластины перед открытием.
После лечения клеток с соответствующим ферментом Master Mix, добавить 2,5 микролитров бесплатной ДНК в качестве шаблона для каждой реакции ПЦР, и добавить грунтовки к окончательной концентрации 1 микромолара для каждой реакции. Затем добавьте 2X концентрацию буфера полимеразы 10X к каждой хорошо, чтобы довести окончательный объем до 25 микролитров на реакцию. И запустить тяжелые и легкие цепные реакции ПЦР каждый в течение 50 циклов.
В конце реакции, запустить образцы на 1%agarose гель для визуализации положительных хитов усиления. Изолировать как парные тяжелые, так и световые цепные реакции от одной и той же клетки через извлечение геля. Определите концентрацию фрагмента ДНК по оптической плотности до 60 для точных расчетов перевязки смеси.
Объедините восстановленные тяжелые и световые фрагменты цепи с фрагментом связующим звеном и основой вектора выражения, используя четырехсерийную реакцию перевязки в соответствии с инструкциями производителя. И трансформировать перевязотические реакции в химически компетентные бактерии в соответствии с инструкциями производителя. После того, как покрытием на антибиотик пластины, добавить четыре миллилитров среднего роста с антибиотиками к оставшейся культуры трансформации для инкубации ночь при 37 градусов по Цельсию на 250 вращений в минуту.
На следующее утро подготовьте минипреп ДНК из ночных культур перевязки в соответствии с инструкциями производителя и определите полученную концентрацию плазмидной ДНК. Чтобы подтвердить антигенную специфичность изолированных антител, трансфект 10 микрограммов ДНК минипрепа с катионическим липидным реагентом в 10 миллилитровой суспензии 293 клеток. Инкубировать клеточной культуры три-четыре дня при 37 градусах по Цельсию и 8%углекислого газа и 125 вращений в минуту.
В конце инкубации центрифугировать культуру в течение 10 минут при 1000 раз г, и восстановить очищенную среду. Измерьте концентрацию IgG в супернатанте через сродство к протеину a и испытаете каждое антитело в supernatant на концентрации 25 микрограмма в миллилитр ELISA против индивидуальных пептидов используемых для вида согласно стандартным протоколам ELISA. Затем подтвердите положительные попадания экрана с помощью дополнительного ELISA, используя разбавления супернатанта IgG для создания кривой концентрации, начиная с 20 микролитров на миллилитр и построения против оптической плотности для каждого антигена, показывающего реактивность к первоначальному экрану ELISA.
Чтобы изолировать специфические антитела антигена от доноров человека, можно разработать ряд цитометрийных ворот, чтобы изолировать целевые в-клетки памяти. Лимфоциты изолированы в зависимости от размера клетки и детализации, используя вперед и стороны рассеяния. После исключения дублетов и мертвых клеток фенотипические маркеры позволяют сегрегацию IgG-положительных CD19-положительных B-клеток и CD27-положительных В-клеток памяти.
Первое считывание одноклеточного клонирования является подтверждением усиления соответствующих тяжелых и легких переменных цепочек. Вот пример очень эффективного усиления из 24 одиночных ячеек с 42%-парным восстановлением после показанного ПЦР. После клонирования IgG вектор экспрессии IgG трансспектирован в эмбрионационную почку человека 293 клетки.
Восстановленные антитела проверяются на оригинальную панель пептидов Тау, забитых для реактивности ELISA. Дополнительное подтверждение затем завершается с использованием кривой концентрации тех же рекомбинантных образцов антител против пептидов, выявленных на начальном экране. Для каждого положительного удара индивидуальный плазмидный клон может быть изолирован от преобразованного пула и подтвержден тем же методом ELISA.
Целью является усиление последовательностей из одиночных ячеек, поэтому самое главное помнить, что любое загрязнение будет усилено во время ПЦР часть этой процедуры. Эта процедура дает нетронутыми рекомбинантных антител человека, что позволяет для очистки и функциональной характеристики столько антител, сколько вы хотите генерировать.
