В этом видео мы описываем модель исследования механизма токсичности амилоидов на мембранном уровне с использованием митохондрий мозга крыс в качестве биологической модели in vitro. Несмотря на накопление отчета, описывающего механизм мембранных возмущений амилоидным агрегатом в системах фосфолипидных моделей, изученных непосредственно напрямую, нацеленных на события, начинающиеся с развития биологической мембраны. В настоящем видео мы описываем амилоидные фибриллы альфа-синуклеина, анализирующие мембрану митохондрий мозга крысы, как биологическую модель in vitro.
Мы считаем, что митохондрии как органеллы с хорошо охарактеризованными мембранами могут обеспечить чрезвычайно полезную биологическую модельную систему для молекулярных исследований, связанных с механизмом амилоидной цитотоксичности на мембранном уровне, связанной с нейродегенеративными заболеваниями. Обезглавить крысу с небольшой гильотиной животных и удалить мозг из шкалы в течение одной минуты после обезглавливания крысы, чтобы ограничить возможное ухудшение митохондриальных свойств. Важно работать быстро и держать все на льду на протяжении всей процедуры.
Вымойте ткань дважды с 30 миллилитров буфера изоляции. Передача в стакан, содержащий холодный буфер изоляции и мелко фарш мозга с ножницами. Перенесите подвеску ткани на 20 миллилитров холодного гомогенизатора dounce.
Гомогенизировать части ткани с помощью девяти вверх и вниз ударов с моторизованным пестиком. Оставьте смесь на льду примерно на 30 секунд после каждого набора из трех ударов гомогенизации, чтобы гомогенат остается холодным. Перенесите гомогенат в предварительно охлажденную центрифугу и центрифугу при 1300 Г в течение трех минут.
Тщательно decant supernatant и передать его в предварительно охлажденной центрифуги трубки. Центрифуга при 21 000 Г в четыре по Цельсию в течение 10 минут. Откажитесь от супернатанта и повторно посовелейте гранулы в градиентной среде плотности, аккуратно помешивая смесь пипеткой.
Центрифуга в роторе с фиксированным углом на 30, 700 G в четыре по Цельсию в течение пяти минут. Используя пипетки Pasteur, удалите острый конец материала, накопленного в верхней части, которые в основном содержат миелин. Добавьте восьмимилитрный буфер изоляции к митохондриальной фракции, аккуратно перемешивая смесь с пипеткой.
Центрифуга в 16, 700 G в четыре по Цельсию в течение 10 минут. Аккуратно удалите супернатант, оставляя дно рыхлой гранулы нетронутыми. Добавьте один миллилитр 10 миллиграмм на миллилитр жирных кислот, свободных BSA в центрифугу трубки, осторожно помешивая смесь с кончиком пипетки.
Составить объем до пяти миллилитров, добавив буфер изоляции. Центрифуга при 6 900 Г в четыре по Цельсию в течение 10 минут. Это должно производить твердые гранулы.
Декант supernatant и мягко повторного перерасхода митохондриальных гранул в буфер изоляции. Разбавить митохондриальный гомогенат до одного миллиграмма на миллилитр с холодным буфером изоляции и поместить в две 1,5 миллилитровые трубки, как правило, 195 микролитр митохондрий на трубку. Добавьте пять микролитров 20% объема Triton X-100 в одну трубку в качестве положительного контроля для максимальной активности ферментов и пять микролитров деионизированной воды в другую трубку для контроля, а затем смешивание с мешалка.
Инкубировать трубки в течение 10 минут в теплой водяной бане установить до 30 Centigrade. Пеллет митохондрии путем центрифугации труб в роторе с фиксированным углом в 16 000 Г четыре по Цельсию в течение 15 минут. Тщательно соберите полученные супернатанты для оценки активности митохондриальной дегидрогеназы малата с помощью стандартного спектрофотометрического анализа, описанного на следующей части.
Рассчитайте целостность митохондриальной мембраны следующим образом. Для определения активности малата дегидрогеназы, пипетка 890 и 880 микролитр 50 миллимолярный буфер Tris-HCL для пустого и образцового теста кюветы соответственно следуют 100 микролитр 50 миллимолярный оксалоацетат и 10 микролитр 10 миллимолярной бета-NADH. Положите кюветы в спектрофотометр и ссылки против пустой.
Добавьте 10 микролитров митохондриального гомогената по миллиграмму на миллилитр, чтобы попробовать кюветт. Немедленно смешайте с помощью инверсии. Рекордное снижение абсорбции из-за окисления NADH на 340 нанометров в течение одной минуты.
Для мерцательной аритмии альфа-синуклеина добавьте 294 микролитра белкового раствора, 200 микромолеров в каждую 1,5 миллилитровую трубку. Затем добавьте шесть микролитров ThT раствора один миллимолярный. Смешайте растворы и инкубировать трубки в термомиксер при 37 Centigrade под постоянным перемешиванием при 800 об/мин.
Для фибрилляции инсулина из крупного рогатого скота добавьте 637 микролитров белкового раствора, 250 микромоляров в 1,5 миллилитровую трубку. Затем добавьте 13 микролитров ThT раствор один миллимолярный с последующим перемешиванием. Добавьте aliquots 200 микролитров белковых растворов к каждой колодец ясной нижней 96-хорошо пластины.
Печать пластины с кристально чистой лентой уплотнения. Загрузите пластину в считыватель пластин Cytation 5 флуоресценции. Измерьте флуоресценцию ThT с 30-минутными интервалами в течение 12 часов.
Используйте возбуждение на 440 нанометров и выбросы на 485 нанометров. Выберите колодцы. Встряхните пластину в течение пяти секунд перед каждым измерением.
Установите температуру на уровне 57 градусов без агитации. Подготовь две серии из 1,5 миллилитровых трубок, содержащих митохондриальные гомогенаты, одну серию для анализа выпуска MDH и другую для митохондриальных измерений ROS. Добавьте алициты свежих или амилоидных фибриллятов альфа-синуклеина, бычьего инсулина или куриного яичного белка к митохондриальному гомогенату, за которым последует мягко трубоукалы.
Инкубационые трубки, содержащие митохондриальные суспензии в течение 30 минут в теплой водяной бане, устанавливаются до 30 по Цельсию. При анализе выброса малат-дегидрогеназ центрифуги инкубировали митохондриальные гомогенаты при 16 000 Г в течение 15 минут. Тщательно соберите полученные супернатанты для анализа активности митохондриального MDH, как описано в разделе протокола 4.
Рассчитайте выпуск MDH следующим образом. Для митохондриального измерения ROS, пипетка 191 микролитер инкубации митохондриального гомогената к каждой колодец 96-хорошо пластины. Добавьте четыре микролитер из 50 микромолейных DCFDA.
Затем добавьте пять микролитров 200 миллимолярный сукчинат. Инкубировать тарелку в течение 30 минут в теплой водяной бане установить до 30 Centigrade при осторожном перемешивании. Загрузите пластину в считыватель пластин Cytation 5 и измерьте интенсивность флуоресценции в соответствии с разделом протокола.
Целостность митохондриальной мембраны оценивалась путем измерения активности MDH в изолированных митохондриях до и после нарушения мембраны и высвобождения ферментов Triton X-100. Как вы видите, мы обычно обнаружили, что митохондриальные препараты около 93%intact. ThT флуоресценция анализ был проведен для мониторинга роста амилоидных фибрилляций.
Кривая для амилоидной фибрилляции трех белков показала типичный сигмоидный узор, достигнув плато примерно в 96, 12 и 96 часов для альфа-синуклеина, бычьего инсулина и лизозима куриного яичного белка соответственно, что свидетельствует о образовании амилоидных фибрилляций, что было более подтверждено измерением AFM. Возможная проницаемая и повреждение митохондриальной мембраны амилоидными фибриллями была исследована путем высвобождения митохондриального MDH и митохондриального измерения ROS. Как вы видите на левом графике, существенное высвобождение MDH наблюдалось при добавлении альфа-синуклеиновых амибриллоидов в митохондрии.
В то время как небольшой релиз был обнаружен инсулин фибрилляции, куриное яйцо белый лизозим фибриллы были признаны неэффективными. Правый график показывает влияние амилоидных фибрилляций на митохондриальное содержание ROS. Хотя никакого значительного улучшения митохондриального ROS не наблюдалось при добавлении лизозима куриного яичного белка или инсулина амилоидных фибрилляций, лечение фибрилляциями альфа-синуклеина привело к значительному увеличению содержания ROS в митохондриях мозга.
Настоящее видео описывает модельное исследование механизма фибулы совокупной цитотоксиситности на мембранном уровне, демонстрируя, как амилоидные фибриллы, возникающие из различных белков, могут вызвать разную степень повреждения мембраны и проницаемости. В то время как некоторые темы амилоидных фибрилляций и их специфической связывающей мембраны, как представляется, обеспечивают способность взаимодействовать с и вызывать дестабилизацию и последующие возмущения мембран. После этого видео, вы сможете исследовать взаимодействие родной формы, до фибриллярия, и зрелые амилоидные фибриллы различных пептидов и с митохондриями изолированы от различных тканей или различных областях мозга.
