Изготовление трубчатых структур является перспективным подходом к тканевой инженерии сосудистых сетей, которая остается одной из основных проблем при выращивании толстых тканей в пробирке. Основным преимуществом метода ядра/оболочки является простое производство полых нитей леса в один шаг, сокращая время изготовления и потенциально позволяя прямой печати с клетками. Подготовка гидрогеля с соответствующими вязко-вещественные свойства, и поддержание непрерывного сбалансированного потока основных / оболочки материалов имеет решающее значение для 3D-печати стабильных лесов.
Для начала заполните стерильный шприц 5 мл свежеприготовленным гидрогелем. Заполните второй шприц 5 мл, оснащенный 27 калибровочных тупых конца иглы, со свежеприготовленным перекрестным раствором. Сопло ядра/оболочки.
Вставьте G27 тупой конец иглы в качестве основного компонента и закрепить иглу с помощью винта. Внутренняя игла должна выступать около 1 мм от внешнего ядра сопла оболочки. Соедините шприц с перекрестным раствором иглы G27 в сопле и загрузите шприц в одну из экструдерных крепления стерилизованного этанолом 3D-принтера.
Накрените шприц гидрогелем во второй экструдер и соедините его с соплом. Используйте замок Luer для подключения короткой трубки к боковой ввод Luer сопла ядра/оболочки. Тщательно вручную отрегулируйте выравнивание до тех пор, пока сопло не коснется поверхности, прежде чем убирать сопло на расстояние, равное внешнему диаметру сопла.
Импорт генерируемых эшафот g-код и нажмите Play, чтобы инициировать процесс печати. После печати, тщательно удалить субстрат с печатной эшафот и залить вторичного перекрестного раствора на весь эшафот. Инкубировать эшафот в течение одной минуты при комнатной температуре.
Чтобы отделить эшафот от субстрата, нежный тянуть эшафот боком. Если эшафот прочно прилип к субстрату, вставьте острый край между обоими материалами, чтобы отделить их. Перенесите эшафот в свежий контейнер.
УФ стерилизовать обе стороны эшафота в течение 30 минут с каждой стороны. Затем поместите эшафот в бесцветную среду культуры клеток и инкубировать эшафот на 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа, по крайней мере 24 часов. На следующий день, урожай huvex из в пробирке культуры с 0,25%трипсина в течение пяти минут при 37 градусов по Цельсию.
Когда клетки отсоединились, остановить энзиматической реакции с 3 мл свежей среды культуры клеток и собирать клетки центрифугации. Повторно приостановить гранулы в свежей среде культуры, содержащей фенол красный, и разбавить клетки в 3,4 раза от 10 до пятой эндотелиальной клетки на миллилитр концентрации. Загрузите клетки в стерильный шприц 5 мл, оснащенный иглой 27 калибра, и найдите точку входа в эшафот.
Выравнивание иглы с прямой секцией леса нити, тщательно проколоть эшафот под низким углом. Подтвердите, что игла находится в полой нити канала и осторожно угнетает поршень, чтобы ввести примерно 1-2 мл клеточной подвески в эшафот. Поток подвески должен быть виден через полупрозрачный эшафот.
Когда весь эшафот был заполнен клеточной подвеской, погрузит эшафот в среду свежей клеточной культуры и верните эшафот в инкубатор клеточной культуры на срок до 10 дней. Для живых / мертвых изображений в конце инкубации, промыть эшафот с PBS, и использовать тупой конец иглы тщательно вводить жить / мертвый раствор в эшафот. Подтвердите, что раствор заполнил весь эшафот, и поместите эшафот при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут.
В конце инкубации, промыть эшафот с PBS, и тщательно перенести эшафот на стеклянную горку. Окрашенные клетки можно наблюдать в лесах под микроскопом флуоресценции. В этом поперечном сечении свеженапечатанных и постобработанных эшафот, четко видимый полый канал можно наблюдать в нити.
Даже после 72 часов инкубации в среде клеточной культуры при 37 градусах по Цельсию, как было продемонстрировано, нить сохраняет полую структуру по всей длине эшафота. Здесь показана репрезентативная живая/мертвая анализ эндотелиальных клеток после 48 часов культуры в эшафоте. Можно определить живые клетки по ярко-зеленому флуоресцентный сигнал.
Этот метод является основой для одношагового изготовления полых трубчатых лесов и может быть модернизирован путем прямой печати с использованием клеток, включенных в био-чернила.
