A fabricação de estruturas tubulares é uma abordagem promissora para a engenharia tecidual de redes vasculares, que continua sendo um dos grandes desafios no cultivo de tecidos grossos in vitro. A principal vantagem da técnica núcleo/concha é a simples produção de andaimes de filamento oco em um único passo, reduzindo o tempo de fabricação e potencialmente permitindo impressão direta com células. Preparar uma formulação de hidrogel com as propriedades viscoelásticas apropriadas e manter um fluxo contínuo e equilibrado dos materiais do núcleo/concha é crucial para a impressão 3D de andaimes estáveis.
Para começar, encha a seringa estéril de 5 mL com hidrogel recém-preparado. Encha uma segunda seringa de 5 mL, equipada com uma agulha de ponta sem corte de 27 calibres, com solução de crosslinking recém-preparada. Monte o bocal do núcleo/concha.
Insira uma agulha de extremidade sem corte G27 como componente do núcleo e aperte a agulha usando o parafuso. A agulha interna deve se projetar cerca de 1 mm do bocal da casca do núcleo externo. Conecte a seringa com a solução de crosslinking à agulha G27 no bocal e carregue a seringa em uma das montagens extrusoras de uma impressora 3D esterilizada por etanol.
Monte a seringa com hidrogel na segunda extrusora e conecte-a ao bocal. Use uma trava Luer para conectar um tubo curto à entrada luer lateral do bocal do núcleo/concha. Ajuste cuidadosamente o alinhamento até que o bocal toque a superfície antes de retrair o bocal a uma distância igual ao diâmetro do bocal externo.
Importe o código g gerado e pressione Play para iniciar o processo de impressão. Após a impressão, remova cuidadosamente o substrato com o andaime impresso e despeje a solução secundária de crosslinking sobre todo o andaime. Incubar o andaime por um minuto em temperatura ambiente.
Para separar o andaime do substrato, puxe suavemente o andaime para os lados. Se o andaime aderir fortemente ao substrato, insira uma borda afiada entre ambos os materiais para separá-los. Transfira o andaime para um recipiente fresco.
UV esterilizar ambos os lados do andaime por 30 minutos por lado. Em seguida, coloque o andaime em um meio de cultura celular incolor e incubar o andaime a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por pelo menos 24 horas. No dia seguinte, colherá huvex de uma cultura in vitro com 0,25% de trippsina por cinco minutos a 37 graus Celsius.
Quando as células se separarem, pare a reação enzimática com 3 mL de meio de cultura celular fresca e colete as células por centrifugação. Suspenda a pelota em meio de cultura fresca contendo fenol vermelho, e dilua as células a 3,4 vezes 10 às quintas células endoteliais por concentração mililitro. Carregue as células em uma seringa estéril de 5 mL equipada com uma agulha calibre 27 e localize um ponto de entrada no andaime.
Alinhando a agulha com a seção reta do filamento do andaime, puna cuidadosamente o andaime em um ângulo baixo. Confirme se a agulha está dentro do filamento oco do canal e pressione suavemente o êmbolo para injetar aproximadamente 1-2 mL de suspensão celular no andaime. O fluxo da suspensão deve ser visível através do andaime translúcido.
Quando todo o andaime estiver cheio de suspensão celular, submergir o andaime em meio de cultura celular fresca e devolver o andaime à incubadora de cultura celular por até 10 dias. Para imagens vivas/mortas no final da incubação, enxágue o andaime com PBS e use uma agulha de ponta sem corte para injetar cuidadosamente solução viva/morta no andaime. Confirme se a solução encheu todo o andaime e coloque o andaime a 37 graus Celsius por 30 minutos.
No final da incubação, enxágue o andaime com PBS e transfira cuidadosamente o andaime para um escorregador de vidro. As células tingidas podem então ser observadas nos andaimes sob um microscópio de fluorescência. Nesta seção transversal de um andaime recém-impresso e pós-processado, um canal oco claramente visível pode ser observado dentro do filamento.
Mesmo após 72 horas de incubação em meio de cultura celular a 37 graus Celsius, como demonstrado, o filamento mantém a estrutura oca durante todo o comprimento do andaime. Aqui, um ensaio representativo ao vivo/morto de células endoteliais após 48 horas de cultura dentro de um andaime é mostrado. As células vivas podem ser identificadas pelo seu sinal fluorescente verde brilhante.
Esta técnica é a base para a fabricação de um passo de andaimes tubulares ocos e pode ser atualizada pela impressão direta usando células incorporadas à bioindadeira.
