La fabricación de estructuras tubulares es un enfoque prometedor para la ingeniería de tejidos de redes vasculares, que sigue siendo uno de los principales desafíos en el cultivo de tejidos gruesos in vitro. La principal ventaja de la técnica de núcleo/cáscara es la producción simple de andamios de filamento hueco en un solo paso, reduciendo el tiempo de fabricación y permitiendo potencialmente la impresión directa con las células. La preparación de una formulación de hidrogel con las propiedades viscoelásticas adecuadas y el mantenimiento de un flujo equilibrado continuo de los materiales del núcleo/cáscara es crucial para la impresión 3D de andamios estables.
Para empezar, llene la jeringa estéril de 5 ml con hidrogel recién preparado. Llene una segunda jeringa de 5 ml, equipada con una aguja de extremo romo de calibre 27, con solución de reticulación recién preparada. Montar la boquilla de núcleo/cáscara.
Inserte una aguja de extremo romo G27 como componente central y fije la aguja con el tornillo. La aguja interior debe sobresalir a aproximadamente 1 mm de la boquilla exterior de la cáscara del núcleo. Conecte la jeringa con la solución de reticulación a la aguja G27 de la boquilla y cargue la jeringa en uno de los soportes de extrusora de una impresora 3D esterilizada con etanol.
Monte la jeringa con hidrogel en el segundo extrusor y conéctela a la boquilla. Utilice un bloqueo Luer para conectar un tubo corto a la entrada Luer lateral de la boquilla de núcleo/cáscara. Ajuste manualmente la alineación hasta que la boquilla toque la superficie antes de retraer la boquilla a una distancia igual al diámetro exterior de la boquilla.
Importe el código g del scaffolding generado y pulse Reproducir para iniciar el proceso de impresión. Después de imprimir, retire cuidadosamente el sustrato con el andamio impreso y vierta la solución de reticulación secundaria sobre todo el andamio. Incubar el andamio durante un minuto a temperatura ambiente.
Para separar el andamio del sustrato, tire suavemente del andamio hacia los lados. Si el andamio se adhiere fuertemente al sustrato, inserte un borde afilado entre ambos materiales para separarlos. Transfiera el andamio a un recipiente nuevo.
Esterilizar UV a ambos lados del andamio durante 30 minutos por lado. A continuación, coloque el andamio en un medio de cultivo celular incoloro e incubar el andamio a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante al menos 24 horas. Al día siguiente, cosecha huvex de un cultivo in vitro con 0.25%trypsin durante cinco minutos a 37 grados centígrados.
Cuando las células se hayan desprendido, detenga la reacción enzimática con 3 ml de medio de cultivo celular fresco y recoja las células por centrifugación. Re-suspender el pellet en medio de cultivo fresco que contiene rojo fenol, y diluir las células a una 3.4 veces 10 a la quinta concentración de células endoteliales por mililitro. Cargue las células en una jeringa estéril de 5 ml equipada con una aguja de calibre 27 y localice un punto de entrada en el andamio.
Alineando la aguja con la sección recta del filamento del andamio, perfore cuidadosamente el andamio en un ángulo bajo. Confirme que la aguja está dentro del filamento hueco del canal y presione suavemente el émbolo para inyectar aproximadamente 1-2 ml de suspensión celular en el andamio. El flujo de la suspensión debe ser visible a través del andamio translúcido.
Cuando todo el andamio se haya llenado con suspensión celular, sumerja el andamio en un medio de cultivo celular fresco y devuelva el andamio a la incubadora de cultivo celular durante un máximo de 10 días. Para imágenes vivas/muertas al final de la incubación, enjuague el andamio con PBS y use una aguja de extremo romo para inyectar cuidadosamente la solución viva/muerta en el andamio. Confirme que la solución ha llenado todo el andamio y coloque el andamio a 37 grados centígrados durante 30 minutos.
Al final de la incubación, enjuague el andamio con PBS y transfiera cuidadosamente el andamio a un portaobjetos de vidrio. Las células teñidas se pueden observar en los andamios bajo un microscopio de fluorescencia. En esta sección transversal de un andamio recién impreso y post-procesado, se puede observar un canal hueco claramente visible dentro del filamento.
Incluso después de 72 horas de incubación en el medio de cultivo celular a 37 grados Celsius como se ha demostrado, el filamento conserva la estructura hueca a lo largo de toda la longitud del andamio. Aquí, se muestra un ensayo representativo vivo/muerto de células endoteliales después de 48 horas de cultivo dentro de un andamio. Las células vivas pueden ser identificadas por su señal fluorescente verde brillante.
Esta técnica es la base para la fabricación de un solo paso de andamios tubulares huecos y se puede actualizar mediante la impresión directa utilizando células incorporadas en la bio-tinta.
