Этот протокол обеспечивает мощную альтернативу для скрининга активности нуклеазы в качестве биомаркера болезни, с простой в реализации методологии даже для исследователей, которые не так специализируются на нуклеиновой кислоты зондов. Основным преимуществом этого метода является возможность выбора зондов нуклеиновой кислоты, которые могут идентифицировать как известные, так и неизвестные действия нуклеазы, пользуясь динамическим взаимодействием зонда и нуклеазы. Другими преимуществами этой методологии являются ее гибкость, высокая воспроизводимость и простота использования.
Демонстрацию пробудут Хадиджа, студентка магистратуры, и Барис, постдок из нашей лаборатории. При проектировании библиотеки олигонуклеотида, включают по крайней мере одну ДНК и один РНК случайной последовательности, содержащей сочетание аденина, гуанина, цитозина и тиамина или uracil. Чтобы подготовить олигонуклеотидные зонды, вращай лиофилизированные олигонуклеотидные зонды и разбавляй каждый зонд в буфере Трис-ЭДТА при концентрации пикомоляра 500 на микролитер для предотвращения деградации нуклеазы.
Для бактериальной культуры на твердой среде, рулон одного пористого стеклянного шарика из криогенного хранения непосредственно на одну культуру блюдо, содержащее TSA дополнены дефибрилированной крови овец, чтобы полоса из отдельных бактериальных колоний. Затем поместите пластину при 37 градусах по Цельсию в течение 24 часов. Для бактериальной культуры в жидкой среде, передача одной колонии от твердой средней культуры до 50 миллилитров TSB для инкубации при 37 градусах Цельсия в течение 24 часов при 200 вращениях в минуту.
На следующий день разбавить культуру в соотношении от одного до 500 в свежем TSB и инкубировать бактерии в течение дополнительных 24 часов при 37 градусах по Цельсию и 200 вращений в минуту в трясущимся инкубаторе. Чтобы настроить анализ активности нуклеазы, сначала предварительно разогрейте флюорометр до 37 градусов по Цельсию и аккуратно добавьте 96 микролитров стерильного TSB или супернатанта из жидкой средней культуры Salmonella или E.Coli в одну 1,5-миллилитровую трубку микроцентрифуга на зонд. Добавьте четыре микролитров зонда рабочего решения для каждой трубки и использовать пипетку, чтобы тщательно смешивать содержимое каждой трубки до тех пор, пока однородные решения не будут достигнуты, заботясь, чтобы избежать пузырьков.
Далее тщательно загрузите 95 микролитров каждого раствора вблизи стенки отдельных колодцев черного дна, необработав 96 колодцев, заботясь о том, чтобы избежать пузырьков. Когда все решения были добавлены, покройте пластину и визуально осмотрите крышку для маркировки пера или пыли, которые могут ввести измерения артефактов. Чтобы настроить программное обеспечение для измерения активности нуклеазы, откройте подходящую программу приобретения.
Выберите Read Now из окна Task Manager и выберите New для создания кинетического протокола измерения. Нажмите Установите температуру, чтобы выбрать 37 градусов по Цельсию и подтвердить и сохранить настройки, нажав OK. Нажмите Начало Кинетики. Во всплывающем окне выберите два часа в поле ввода Run Time и две минуты в поле ввода интервала перед нажатием OK для подтверждения и сохранения настроек.
Нажмите Читать. Во всплывающем окне выберите интенсивность флуоресценции в качестве метода обнаружения, Endpoint Kinetic как тип чтения и фильтры в качестве типа оптики. Тогда нажмите OK. Во всплывающем окне выберите Green из набора фильтров и нажмите OK. В окне Процедуры выберите крышку use и нажмите Validate.
Появится всплывающее окно, подтверждающее, что созданный протокол действителен. В меню Протокола выберите Процедуру. В окне Процедуры определите скважины, которые будут измерены, и введите название эксперимента в поле ввода имени файла.
Затем загрузите пластину в считыватель пластин, заботясь о том, чтобы пластина была в правильном направлении, и нажмите кнопку Read New, чтобы начать приобретение. Для анализа данных откройте данные в соответствующем программном обеспечении анализа и выберите одну из измеренных скважин в окне пластины. Нажмите Выберите Уэллс и включите все измеренные скважины в окно Well Selection Dialog перед нажатием OK. Затем выберите данные в окне одного листа, чтобы визуализировать результаты таблицы и нажмите кнопку «Быстрыйэкспорт», чтобы экспортировать данные в электронную таблицу.
В электронной таблице отмекать столбцы данных по мере необходимости для каждого образца и зонда, а также построить относительные единицы флуоресценции по сравнению со временем для данных для создания кинетических графиков. В этом репрезентативном эксперименте, после первого раунда скрининга, супернатанты культуры сальмонеллы сообщили о явном предпочтении РНК-зондов над зондами ДНК. На основе определения РНК в качестве предпочтительного типа нуклеиновой кислоты ядрами сальмонеллы, новая библиотека только для РНК предназначена для использования во втором раунде скрининга.
В отличие от этого, E.Coli в культуре среднего контроля продемонстрировали очень ограниченную способность деградировать РНК-зондов. После второго раунда скрининга с использованием химически модифицированных нуклеотидов, направленных на повышение специфичности РНК-зондов, РНК пиримидин 2'O-метил и РНК пурин 2'O-метил могут быть определены на основе их химических модификаций как выставление наиболее эффективных кинетического поведения по сравнению с РНК пиримидин 2'fluoro и РНК purine 2'fluoro соответственно. Эти результаты показывают, что salmonella имеет важную активность РНКС с дифференциальным предпочтением химии субстрата, которые могут быть использованы для выбора зондов, способных специально распознать эту бактерию.
Эта процедура позволяет от выбора зондов, которые способны определить нуклеазы деятельности, связанные с заболеваниями, такими как рак или бактериальная инфекция, что позволяет разработать новые клинические диагностические инструменты.
