Этот протокол предлагает биотин-маркированную платформу для изучения взаимодействий белково-нуклеиновой кислоты, которая оказывается надежной, надежной, эффективной и доступной. Одна и та же партия ядерок, помеченных биотином, может использоваться в течение длительного периода времени, сохраняя воспроизводимость экспериментов. Наконец, все описанные здесь анализы с биотиновой маркировкой могут быть выполнены в течение дня и не требуют специального оборудования.
Демонстрацией процедуры будет Лина Yu, аспирант нашей лаборатории. Подготовь конструкции MEIOB и MOV10 и преобразуйте их в соответствующие бактерии. Чтобы извлечь MEIOB, гранулы клеток через центрифугации и повторно использовать их в 20 миллилитров ледяной фосфат Dulbecco буфера солевого раствора, или DPBS, буфер.
Sonicate бактериальной суспензии на льду. Затем центрифуга лизировать при 12 000 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение 15 минут, и передать супернатант в свежую трубку. Предварительно мыть глутатион-сефароза бусы, и инкубировать их с лизатом при четырех градусах по Цельсию в течение двух часов.
Центрифуга смеси в 750 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение одной минуты, чтобы гранулировать бисер. Промыть бисер 10 миллилитров ледяной PBS восемь раз. Затем добавьте один миллилитр буфера элюции, инкубировать бисер при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут, и elute бусы через центрифугации.
Повторите elution шесть раз, и объединить шесть фракций. Перенесите элалированные белки в центробежный фильтр и сосредоточьтесь на центрифуге в 7500 раз г для конечного объема от 100 до 200 микролитров. Чтобы извлечь MOV10, выразите белок в клетках HEK293T и гранулы клеток в соответствии с рукописными направлениями.
Повторное использование гранул в трех миллилитров буфера лиза клеток с полным EDTA-бесплатный ингибитор протеазы коктейль, и инкубировать в течение 30 минут на льду. Затем центрифуга лисируют при четырех градусах по Цельсию. Подготовка анти-FLAG магнитных бусин, мыть их дважды с буфером K150.
После мытья, повторно использовать бисер в один миллилитр ледяной буфер K150 и инкубировать их в течение двух минут при четырех градусах по Цельсию с нежным вращением. Соберите бисер на магните, и удалить супернатант. Добавить бисер в клетку лисировать, и инкубировать при четырех градусах по Цельсию в течение двух часов.
Вымойте бусины буфером K150 в соответствии с рукописными указаниями и повторно поместите шарики в 300 микролитров буфера ELution FLAG. Поместите бисер на магнит, соберите супернатант с белками MOV10 и определите концентрацию белка. Подготовь РНК-олигонуклеотиды, разбавляя каждый олиго до 20 микромолей и разглаголяя их для формирования РНК-дуплексов в соответствии с рукописными указаниями.
Для анализа электрофоретической подвижности MEIOB, или EMSA, смешайте реагенты в соответствии с рукописными указаниями. Добавьте воду для окончательного объема реакции 20 микролитров. Инкубировать реакцию при комнатной температуре в течение 30 минут, а затем добавить 5x стоп буфера.
Для анализа активности helicase MOV10 смешайте реагенты в соответствии с рукописными указаниями и добавьте воду для окончательного объема реакции в 20 микролитров. Инкубировать реакцию при 37 градусах по Цельсию в течение 10 минут, 30 минут и 60 минут, а затем добавить 5x остановить буфер, чтобы остановить реакцию. Затем приготовьте 20%родной полиакриламинидный гель и загрузите в каждую колодец от 20 до 25 микролитров каждого образца.
Вы запустите гель на 100 вольт на ледяной ванне, пока бромофено-голубой маркер мигрировал в нижнюю четверть геля. Акриламид вреден и токсичен. Важно обращаться с ним с соответствующими средства индивидуальной защиты.
Разобрать гелеобразные пластины и обрезать гель, удалив погрузочные скважины и неиспользованные полосы движения. Поместите гель в буфер TBE 0.5x. Вырезать фильтровальную бумагу и нейлоновую мембрану до размера геля, предварительно промокнуть бумагу и мембрану, и собрать стек для передачи.
Передача образцов из геля в мембрану в полусухом электрофоретном аппарате на 90 миллиамперов в течение 20 минут. Затем перекрестие образцов путем облучения мембраны на 120 миллиджоулей на сантиметр в квадрате в течение 45 до 60 секунд. Для обнаружения хемилюминесценции начните с добавления 20 миллилитров блокирующего буфера в мембрану и инкубации в течение 15-30 минут при мягкой тряске.
Аккуратно удалите блокирующий буфер и замените его спряженным/блокирующим буфером. Снова инкубировать мембрану в течение 15 минут. Вымойте мембрану четыре раза при встряхивании в течение пяти минут за стирку.
Затем добавьте 30 миллилитров буфера субстрата эквилибрации в мембрану и инкубировать его в течение пяти минут при встряхивании при 20-25 об/мин. Обложка всей поверхности мембраны с субстратом рабочий раствор, и инкубировать в течение пяти минут. После инкубации сканируйте мембрану в химилюминесцентной системе визуализации в течение одной-трех секунд.
Очистка белков MEIOB A, C и E может быть проверена с помощью голубого окрашивания Кумасси и анализа западной помарки. Красные стрелки указывают на положение очищенных белков MEIOB. Взаимодействия MEIOB и одной нити ДНК могут быть визуализированы с помощью EMSA.
Наблюдаются концентрациозависимые связывания и расщепления. Как и ожидалось, только дикий тип MEIOB-A взаимодействует с ДНК, в то время как мутант MEIOB-E и MEIOB-C этого не делают. Также можно наблюдать взаимодействие MEIOB и одноструйной РНК.
Дикий тип MEIOB показывает концентрациозависимые связывания и экзонуклеазы деятельности на одноструйной РНК. Однако количественное сравнение показывает, что MEIOB связывает ДНК с более высокой эффективностью, чем РНК. Очистка MOV10 была проверена с помощью голубого окрашивания Кумасси, а активность белка была измерена на дуплексе РНК с пятисвятким навесом.
По мере увеличения времени реакции MOV10 постепенно раскручивает двухструвую РНК. Чтобы снизить стоимость анализа, обнаружение химилюминесценции может быть выполнено либо с двукратным разбавлением реагентов комплекта обнаружения, либо с самодельными реагентами. В описанной здесь протоколе успешно используются биотиновые нуклеиновые кислоты в качестве субстратов для биохимических анализов in vitro, таких как EMSA, и для энзиматических реакций, в которых биотин не используется широко.
