Селективный внутрибрхиальный метод имеет важное значение, поскольку он предлагает следователям воспроизводимую и нелеталетаную модель для изучения острой травмы легких, основной причиной острого респираторного дистресс-синдрома у человека. Преимуществом селективного внутрибрхиального метода является локализация воспалительной реакции на левое легкое, предлагающая правое легкое в качестве невредимого контроля и минимизирующие страдания животных. Демонстрацией этой процедуры будет Александр Таварес, техник и студент-преградист нашей лаборатории.
Чтобы подготовить 0,1 нормальной соляной кислоты, добавьте 11 миллилитров двойной дистиллированной воды в бутылку янтарного стекла, а затем медленное добавление одного миллилитра 37%12 нормальной кислоты. Затем медленно добавьте четыре миллилитров одного нормального кислотного рабочего запаса в 35 миллилитров двойной дистиллированной воды в 50-миллилитровой конической трубке. Затем используйте электронный зонд рН для измерения рН нормального стокового раствора 0,1, присев на рН 1,1 с использованием гидроксида натрия или кислотного раствора по мере необходимости до конечного объема в 40 миллилитров.
Перед началом процедуры, фильтр от одного до двух миллилитров кислотного раствора через стерильный фильтр 0,22 микролитера в стерильную трубку микроцентрифуга и подтвердить отсутствие реакции на болевой рефлекс в анестезированной мыши. Используя электрические клиперы при медленных нисходящих ударах, аккуратно брейте хирургическую область на брюшной поверхности мыши ниже подбородка в шейном отделе горла. Удалите любые свободные волосы, и мазок подвергаются кожи с тремя последовательными 10%povidone йода раствора и 70%isopropyl спирта тампоны.
Когда кожа была подготовлена, поместите мышь в положение на спине на чистой хирургической доске, и покрыть животное стерильной хирургической драпировки. Сделайте продольное отверстие 0,5 сантиметра в коже над трахеей и слюнными железами, и используйте слегка изогнутые зубчатые миппы, чтобы тщательно втягивать кожу. Аккуратно отделить слюнные железы подвергать трахеи мышц и использовать слегка изогнутые зубчатые миппы, чтобы мягко раздвинуть паратрахальные мышцы.
Дразнить от фасции окружающих трахею, пока cartilaginous кольца трахеи полностью подвергаются, и использовать полностью изогнутые зубчатые миппы для работы от соединительной ткани между ретротрахеей и ретрофашии. Слайд полностью изогнутые зубчатые тибры за трахеей и поднимите трахею. После того, как кончик типса находится за трахеей, схватить от 10 до 15 сантиметров кусок 4-0 плетеный шелковый шов с кончиками типсов и тянуть шов за трахею так, что есть цыпяная длина с обеих сторон.
Хирургическая доска может быть повернута, чтобы приблизить хирургическую область к доминирующей руке для следующих шагов. Затем осторожно потяните концы шва к передней части мыши, и удерживайте концы на месте. Для канюляции левого основного бронха, разоблачить иглу 24-го калибра на 3/4-дюймовый ангиокатетер и вставить сторону скошенной иглы вверх в внутреннюю область трахеи между первым и вторым трахеей кольца.
Когда кончик иглы можно визуализировать в пределах трахеи люмена, отпустите шов и заранее канюли над иглой в трахею рыбалка к левой задней стороне мыши. Когда сопротивление столкнулось, свясть иглу. После того, как канюля на месте, твердо схватить инъекционный порт, чтобы предотвратить катетер от смещения и обеспечить P-200 микропипетт отзыв в порту.
Затем привить 50 микролитров фильтрованного 0,1 нормального кислотного раствора в катетер, а затем равный объем воздуха. Этот шаг требует точного манипулирования канюлей, в то время как дыхательные пути затруднены, и должны быть завершены быстро и плавно, чтобы восстановить надлежащий поток воздуха и свести к минимуму повреждения дыхательных путей. Быстро свяйте катетер и наклоните хирургическую доску под углом 60 градусов.
Через 30 секунд положите хирургическую доску и снимите шов из-за трахеи. Затем используйте 4-0 воск покрытием плетеные шелковые швы, чтобы закрыть разрез кожи с двумя-тремя стежками. Острая травма легких в результате внутрибрхиальной кислоты закапывания включает в себя все левое легкое.
Действительно, после внутривенного введения Эванс синий краситель и перфузия легких, краситель обнаруживается только в левом легком. Количественная оценка экстравазии красителя в левое легкое значительно увеличивается по сравнению с фиктивным селективным закапыванием. Интерстициальные нейтрофилов накапливаются в левом легком через 24 часа после закапывания кислоты в отличие от правого легкого, в котором наблюдается несколько интерстициальных нейтрофилов.
Гистология легких выявляет повреждения тканей и воспаление на уровне органов и клеток с экссудативным воспалением через 24 часа после травмы, характеризующейся отмеченным альвеолярным отеком и инфильтрацией нейтрофила в левом легком. Обратите внимание, что отсутствие значительных травм или лейкоцитов притока в невредимым контроля правого легкого. Через 72 часа после травмы отек и клеточные инфильтраторы существенно уменьшились, что представляет собой разрешающий экссудативную фазу.
По оценке цитометрии потока, альвеолярные нейтрофиловы увеличиваются в левом легком через 24 часа после первоначальной травмы и существенно уменьшаются на 48 и 72 часа. Важно визуализировать катетер в трахее перед продвижением. Угол канюли к левой основной бронхов во время вставки и следовать кислоты закапывания с 50 микролитров воздуха.
Бронхоалвеолярный анализ жидкости лаважа, гистология легких, фенотипирование иммунных клеток путем цитометрии потока, живая визуализация мыши и тестирование легочной функции могут быть выполнены для оценки воспаления и разрешения. Разработка этой самооправлимой модели острой травмы легких позволила исследователям внести значительный вклад в область биологии разрешения. Помните, что концентрированная соляная кислота опасна и что она должна быть обработана в химическом капюшоне, нося соответствующее средства индивидуальной защиты.
