Die selektive intrabronchiale Methode ist signifikant, weil sie den Forschern ein reproduzierbares und nichttödliches Modell für die Untersuchung akuter Lungenverletzungen bietet, eine Hauptursache für das akute Atemnotsyndrom beim Menschen. Der Vorteil der selektiven intrabronchialen Technik ist die Lokalisation der Entzündungsreaktion auf die linke Lunge, die die rechte Lunge als unverletzte Kontrolle und minimierende Tiernot bietet. Demonstriert dieses Verfahren wird Alexander Tavares, ein Techniker und Pregraduate Student in unserem Labor.
Um 0,1 normale Salzsäure vorzubereiten, fügen Sie 11 Milliliter doppelt destilliertes Wasser in eine Bernsteinglasflasche, gefolgt von der langsamen Zugabe von einem Milliliter 37%12 Normalsäure. Als nächstes fügen Sie langsam vier Milliliter eines normalen Saure-Arbeitsbestands in 35 Milliliter doppelt destilliertes Wasser in einem 50-Milliliter-Konustube hinzu. Verwenden Sie dann eine elektronische pH-Sonde, um den pH-Wert der 0,1-Normalstofflösung zu messen, indem Sie mit Natriumhydroxid oder Säurestammlösung nach Bedarf auf ein Endvolumen von 40 Millilitern auf einen pH-Wert von 1,1.
Vor Beginn des Verfahrens ein bis zwei Milliliter der Säurelösung durch einen sterilen 0,22-Mikroliter-Filter in ein steriles Mikrozentrifugenrohr filtern und einen Mangel an Reaktion auf Schmerzreflexe in einer anästhesierten Maus bestätigen. Mit elektrischen Clippers in langsamen Abwärtsschlägen rasieren Sie sanft den operationsdünnen Bereich auf der ventralen Oberfläche der Maus unterhalb des Kinns im Halsbereich des Rachens. Entfernen Sie lose Haare und wischen Sie die exponierte Haut mit drei aufeinanderfolgenden 10%povidon-jodine Lösung und 70%isopropyl Alkohol tupfer.
Wenn die Haut vorbereitet wurde, legen Sie die Maus in die Supine-Position auf einem sauberen operationsärztlichen Brett und bedecken Sie das Tier mit einem sterilen chirurgischen Vorhang. Machen Sie eine längsige 0,5 Zentimeter Öffnung in der Haut über der Luftröhre und Speicheldrüsen, und verwenden Sie leicht gekrümmte gezackte Zangen, um die Haut vorsichtig zurückzuziehen. Trennen Sie die Speicheldrüsen sanft, um die Luftröhrenmuskeln freizulegen, und verwenden Sie leicht gekrümmte gezackte Zangen, um die Bauchmuskeln sanft auseinander zu schieben.
Die Faszien, die die Luftröhre umgeben, so lange absanieren, bis die Knorpelringe der Luftröhre vollständig freigelegt sind, und verwenden Sie vollständig gekrümmte gezackte Zangen, um das Bindegewebe zwischen Retrotrachea und Retrofascia abzuarbeiten. Schieben Sie voll gekrümmte gezackte Zangen hinter die Luftröhre und heben Sie die Luftröhre an. Sobald sich die Spitze der Zange hinter der Luftröhre befindet, greifen Sie ein 10 bis 15 Zentimeter großes Stück 4-0 geflochtene Seidennaht mit den Spitzen der Zange und ziehen Sie die Naht hinter der Luftröhre, so dass es auf beiden Seiten eine gleichmäßige Länge gibt.
Das Operationsbrett kann gedreht werden, um den Operationsbereich näher an die dominante Hand für die nächsten Schritte zu bringen. Ziehen Sie dann sanft die Enden der Naht in Richtung der Vorderen der Maus, und halten Sie die Enden an Ort und Stelle. Für die Konservenierung des linken Mainstammbronchus, setzen Sie die Nadel eines 24-Spurdurchmessers durch 3/4-Zoll-Angiokatheter aus und setzen Sie die Nadelschräge seite in den inneren Bereich der Luftröhre zwischen dem ersten und zweiten Trachealringen ein.
Wenn die Nadelspitze innerhalb des Luftröhrenlumens visualisiert werden kann, lassen Sie die Naht los und bringen Sie die Kanüle über die Nadel in die Luftröhre, die zur linken hinteren Seite der Maus angelt. Wenn Widerstände auftreten, ziehen Sie die Nadel zurück. Sobald die Kanüle an Ort und Stelle ist, greifen Sie den Injektionsanschluss fest, um zu verhindern, dass sich der Katheter verschiebt, und sichern Sie eine P-200-Mikropipettespitze im Anschluss.
Dann 50 Mikroliter der gefilterten 0,1 Normalsäurelösung in den Katheter einfließen, gefolgt von einem gleichen Luftvolumen. Dieser Schritt erfordert eine präzise Manipulation der Kanüle, während die Atemwege verstopft sind, und sollte schnell und reibungslos abgeschlossen werden, um den richtigen Luftstrom wiederherzustellen und Atemwegsschäden zu minimieren. Ziehen Sie den Katheter schnell zurück und neigen Sie das Operationsbrett in einem 60-Grad-Winkel.
Legen Sie nach 30 Sekunden das OPERATIONSbrett flach, und entfernen Sie die Naht hinter der Luftröhre. Verwenden Sie dann eine 4-0 wachsbeschichtete geflochtene Seidennaht, um den Hautschnitt mit zwei bis drei Stichen zu schließen. Die akute Lungenverletzung, die durch die inbronchiale Säureinstillation entsteht, betrifft die gesamte linke Lunge.
Tatsächlich wird der Farbstoff nach intravenöser Verabreichung von Evans Blaufarbstoff und Lungenperfusion nur in der linken Lunge nachgewiesen. Die Quantifizierung der Farbstoff-Extravasation in die linke Lunge ist im Vergleich zur Schein-Selektivinstillation signifikant erhöht. Interstitielle Neutrophile sammeln sich 24 Stunden nach der Säureinstillation in der linken Lunge an, im Gegensatz zur rechten Lunge, in der nur wenige interstitielle Neutrophile beobachtet werden.
Lungenhistologie zeigt Gewebeverletzungen und Entzündungen auf Organ- und Zellebene mit exsudativer Entzündung 24 Stunden nach der Verletzung, die durch ausgeprägte Alveolarödeme und neutrophile Infiltration in der linken Lunge gekennzeichnet ist. Beachten Sie, dass das Fehlen einer erheblichen Verletzung oder Leukozytenzustrom in die unverletzte Kontrolle rechte Lunge. 72 Stunden nach der Verletzung werden ödeme und zelluläre Infiltrate wesentlich verringert, was eine lösende Exsudativphase darstellt.
Wie durch Durchflusszytometrie beurteilt, alveolare Neutrophilen erhöhen sich in der linken Lunge 24 Stunden nach der anfänglichen Verletzung, und deutlich abnehmen bei 48 und 72 Stunden. Es ist wichtig, den Katheter in der Luftröhre vor dem Fortschreiten zu visualisieren. Winkeln Sie die Kanüle während des Einsetzens in Richtung des linken Hauptstammbronchus und folgen Sie der Säureinstillation mit 50 Mikroliter Luft.
Bronchoalveolare Lavage-Flüssigkeitsanalyse, Lungenhistologie, Immunzell-Phänotypisierung durch Durchflusszytometrie, Live-Maus-Bildgebung und Lungenfunktionstests können alle durchgeführt werden, um die Entzündung und Auflösung zu bewerten. Die Entwicklung dieses selbstbegrenzten Modells akuter Lungenverletzungen hat es Forschern ermöglicht, einen bedeutenden Beitrag auf dem Gebiet der Auflösungsbiologie zu leisten. Denken Sie daran, dass konzentrierte Salzsäure gefährlich ist und dass sie in einer chemischen Kapuze mit der entsprechenden persönlichen Schutzausrüstung behandelt werden sollte.
