선택적 기관지 내 방법은 연구원에게 급성 폐 상해를 연구하기위한 재현 가능하고 치명적이지 않은 모델을 제공하기 때문에 중요합니다. 선택적 기관지 기술의 장점은 왼쪽 폐에 대한 염증 반응의 국소화가 부상되지 않은 제어로 오른쪽 폐를 제공하고 동물의 고통을 최소화한다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 알렉산더 타바레스, 우리의 실험실에서 기술자 및 대학원 학생이 될 것입니다.
0.1 일반 염산을 준비하려면 호박색 유리 병에 이중 증류수 11 밀리리터를 넣고 정상 산 37%12의 1밀리리터를 느리게 첨가합니다. 다음으로, 50밀리리터 원뿔형 튜브에 35밀리리터 이중 증류수에 정상 산 작업 재고 1개 밀리리터 4밀리리터를 천천히 넣습니다. 그런 다음 전자 pH 프로브를 사용하여 0.1 정상 재고 용액의 pH를 측정하고, 필요에 따라 수산화 나트륨 또는 산 재고 용액을 사용하여 1.1의 pH로 적정하여 40 밀리리터의 최종 부피에 필요한 경우.
시술을 시작하기 전에 멸균 0.22 마이크로리터 필터를 통해 산용액의 1~2밀리리터를 멸균 마이크로센심분리기 튜브로 필터링하고 마취된 마우스의 통증 반사에 대한 반응부족을 확인한다. 느린 하향 스트로크에 전기 클리퍼를 사용하여 목구멍의 자궁 경부 부위에서 턱 아래 마우스의 복부 표면에 수술 부위를 부드럽게 면도합니다. 느슨한 모발을 제거하고 노출된 피부를 3회 연속 10%의 포비도요오드 용액과 70%의 이소프로필 알코올 면봉으로 면봉합니다.
피부가 준비되면 깨끗한 수술판에 마우스를 척추 위치에 놓고 멸균 수술 커튼으로 동물을 덮습니다. 기관지와 타액 선지 위의 피부에 세로 0.5센티미터의 개구부를 만들고 약간 구부러진 톱니 모양의 집게를 사용하여 피부를 조심스럽게 후퇴시킵니다. 타액 샘을 부드럽게 분리하여 기관 근육을 노출시키고 약간 구부러진 톱니 모양의 집게를 사용하여 비아트라셔 근육을 부드럽게 밀어냅니다.
기관의 카르틸라기 고리가 완전히 노출 될 때까지 기관 주변의 근막을 애타게하고, 완전히 곡선 된 톱니 모양의 집게를 사용하여 레트로 트라치아와 레트로 파시아 사이의 결합 조직을 제거합니다. 기관 뒤에 완전히 구부러진 톱니 모양의 집게를 밀어 내고 기관지 리프트를 들어 올립니다. 집게의 끝이 기관 뒤에 있으면 집게의 팁으로 4-0 편조 실크 봉합사의 10 ~ 15 센티미터 조각을 잡고 기관 뒤에 봉합사를 당겨 양쪽에 균일 한 길이가 있습니다.
수술 위원회는 다음 단계에 대한 지배적 인 손에 가까운 수술 영역을 가지고 설정 될 수있다. 그런 다음 봉합사의 끝을 마우스의 앞쪽으로 부드럽게 당기고 끝을 제자리에 고정시합니다. 좌주줄기 기관지의 캔터레이션을 위해 24게이지의 바늘을 3/4인치 협막시터로 노출시키고 바늘 벨면을 제1 및 제2 기관 고리 사이의 기관 지내 부위에 삽입한다.
바늘 끝이 기관 루멘 내에서 시각화 될 수 있는 경우 봉합사를 해제 하 고 쥐의 왼쪽 후방 측면을 향해 매달려 기관으로 바늘 위에 캐뉼라를 진행 합니다. 저항이 발생하면 바늘을 철회하십시오. 캐뉼라가 제자리에 있으면 카테터가 이동하지 못하도록 주입 포트를 단단히 잡고 포트 내에서 P-200 마이크로 피펫 팁을 고정하십시오.
그런 다음 여과 된 0.1 정상 산 용액의 50 마이크로 리터를 카테터에 주입한 다음 동일한 양의 공기가 있습니다. 이 단계는 기도가 막히는 동안 캐뉼라를 정밀하게 조작해야 하며 적절한 기류를 복원하고 기도 손상을 최소화하기 위해 신속하고 원활하게 완료되어야 합니다. 카테터를 빠르게 철회하고 수술판을 60도 각도로 기울입니다.
30 초 후, 수술 보드를 평평하게 놓고 기관 뒤에서 봉합사를 제거하십시오. 그런 다음 4-0 왁스 코팅 편조 실크 봉합사를 사용하여 2 ~ 3 개의 바늘로 피부 절개를 닫습니다. 기관지산 주입으로 인한 급성 폐 손상은 왼쪽 폐 전체를 수반합니다.
실제로, 에반스 블루 염료와 폐 관류의 정맥 투여에 따라, 염료는 왼쪽 폐 내에서만 검출된다. 왼쪽 폐내염 사치의 정량화는 가짜 선택적 주입에 비해 현저히 증가한다. 간질 호중구는 산성 주입 후 24시간 후 왼쪽 폐에 축적되며, 이는 중간 성호성구가 거의 관찰되지 않는 오른쪽 폐와 대조적이다.
폐 조직학은 왼쪽 폐 내의 현저한 폐종 및 호중구 침투를 특징으로하는 부상으로 24 시간 후에 증식 염증을 가진 장기 및 세포 수준에서 조직 상해 및 염증을 밝힙니다. 심각한 부상이나 백혈구가 손상되지 않은 제어 오른쪽 폐로 유입되지 않는 점에 유의하십시오. 부상 후 72시간 부종과 세포 침투는 실질적으로 감소되어 해결 단계를 나타냅니다.
혈류 세포측정에 의해 평가되는 바와 같이, 폐포호중구는 초기 부상 후 24시간 왼쪽 폐에서 증가하고, 48시간 및 72시간에서 실질적으로 감소한다. 전진하기 전에 기관에서 카테터를 시각화하는 것이 중요합니다. 삽입 하는 동안 왼쪽 메인 스템 기관지쪽으로 캐뉼라를 각도 하 고 공기의 50 마이크로 리터와 산 주입을 따라.
기관지 용암 액액 분석, 폐 조직학, 유동 세포측정에 의한 면역 세포 페노티핑, 살아있는 마우스 이미징 및 폐 기능 테스트는 모두 염증 및 분해능을 평가하기 위해 수행될 수 있다. 급성 폐 손상의이 자기 제한 모델의 개발은 연구원이 해상도 생물학의 분야에 중요한 기여를 할 수 있었습니다. 농축 염산은 위험하며 적절한 개인 보호 장비를 착용한 화학 후드에서 처리해야한다는 것을 기억하십시오.
