Количественная мультиплексированная ко-иммунопреципиентация, или ЗМИ, позволяет пользователям одновременно измерять сотни бинарных взаимодействий в предопределенной сети взаимодействия белка. Выполняя несколько со-IPs одновременно в том же лизе, биоинформатики методы могут затем изучить, как группы совместного объединения изменения в скоординированной основе. Анализ отнимая много времени на разработку, но как только панель qMI находится в руке, данные сетевого масштаба могут быть собраны о системах передачи сигналов в относительно просто ночном анализе.
«МИ требует точного пипетки различных образцов и реагентов в 96 пластин. При настройке и запуске каждого анализа следует принимать осторожные заметки для предотвращения ошибок. Для подготовки образца и иммунопреципиентации, начните с облизывания образца в подходящем моющее средство с ингибиторами протеазы и фосфатазы в течение 15 минут инкубации на льду.
В конце инкубации, спина вниз образца для удаления мембран и мусора и выполнить анализ BCA на супернатант, чтобы определить концентрацию белка в соответствии со стандартными протоколами. После нормализации концентрации белка, подготовить магнитный шарик мастер смесь, которая содержит около 250 магнитных бусин каждого класса на колодец. Используйте магнитное разделение для мытья магнитной смеси шарика два раза в буфере Fly P, прежде чем повторно использовать бисер в 20 микролитров буфера Fly P на образец.
После тщательного пипетки, aliquot 20 микролитров бисера в одну ледяную микроцентрифугную трубку на образец и добавить равные объемы лизата с нормализованными концентрациями белка в каждой трубке для иммунопреципиентации. Затем разделите каждый образец лизата на одну трубку для каждой запущенной пластины и проясните образцы на ротаторе при четырех градусах Цельсия, защищенных от света. На следующее утро используйте магнитную стойку шарика, чтобы удалить лизат из первого набора трубок и мыть бисер два раза в 500 микролитров ледяной Fly P буфера за стирку.
После расчета объема повторного получения, повторное использование иммунопрециатов в расчете объема ледяного буфера Fly P. Тщательно resuspend магнитные бусины нежной пипетки и распространять 25 микролитров бисера на колодец через плоский дном 96 хорошо пластины на льду. В другой пластине 96 хорошо, разбавленный attinilated антителами зонда к 2 временам работая концентрации.
Используйте многоканальный пипетку для распределения 25 микролитров каждого зонда антитела разбавления в соответствующие скважины магнитной шарик, содержащий анализ пластины и встряхнуть на высокой скорости на горизонтальной шейкер пластины смешивать и повторно магнитных бусин. После смешивания, уменьшить скорость в течение одного часа инкубации на четыре градуса по Цельсию защищены от света. В конце инкубации, мыть пластину три раза со свежим буфером Fly P на стирку на магнитной шайбе пластины при четырех градусах по Цельсию.
После последней стирки, повторно использовать бисер в 50 микролитров стрептавидина PE разбавленной от одного до 200 в буфере Fly P. Встряхните смесь и повторно поместите шарики перед инкубацией пластины при четырех градусах По Цельсию в течение 30 минут, защищенных от света. В конце инкубации трижды вымойте пластину буфером Fly P на шайбе магнитной пластины при четырех градусах по Цельсию и повторно помесив бисер в 125 микролитров буфера Fly P.
Встряхните тарелку в течение одной минуты при 900 вращениях, чтобы тщательно повторно использовать бисер и загрузить пластину в рефрижерированный цитометр потока. В программном обеспечении цитометра потока выберите параметр High RP1 Target, состояние остановки 1000 бусин на область и объем выборки 80 микролитров. Пауза запустить на полпути через и повторно beads для предотвращения урегулирования.
В конце запуска экспортировать файлы данных в формате XML. Для выполнения анализа АНК заполните входной файл АНК, чтобы отразить детали экспериментального проектирования и запустить программу, которая напишет файл CSV в активный каталог. Файл, заканчивающийся хитами.
csv сообщит о со-ассоциациях протеина которые значительно друг на ложноположивном уровне 0.05 между управлением и экспериментальными условиями в по крайней мере 3 из 4 экспериментальных репликаций. Для взвешенного анализа сети корреляции вставьте заголовки столбца вывода файла данных Matlab, заканчивающийся в mfi. csv в первую колонку новой таблицы и добавить столбцы Эксперимент для эксперимента номер и лечение для экспериментального лечения и любых других переменных, которые будут проанализированы.
Сохраните этот файл в качестве признаков. csv и открыть R Studio. Установите рабочий каталог на папку, содержащую мфо.
csv и черты. csv файлы, выделить разделы кода, и ударил Команды Введите для запуска команд R, как указано в прокомментировал командный файл. Взвешенные модули сетевого анализа корреляции, значительно коррелированные с каждой экспериментальной чертой, будут выводиться в качестве графического файла, а корреляция каждого взаимодействия с каждым модулем будет выводиться в качестве файла CSV.
Для каждого взаимодействия в файле вывода АНК определите, является ли это взаимодействие также значительным CNA, и создайте новую колонку, которая указывает, является ли каждый удар АНК также хитом CNA. Преобразование значений для изменения двухкратных раз и расчета среднего значения для всех хитов CNA профсоюза АНК. Наконец, сделайте новую таблицу с каждым хитом профсоюза АНК CNA, перечисленным его целью иммунопреципиентации в одной колонке, ее целью зонда во второй колонке и значением изменения складок в третьей колонке.
Импорт этого файла в Cytoscape как сеть для создания диаграммы кромки узла. Взаимодействия белков высокой уверенности, выявленные двумя независимыми статистическими подходами, визуализируются как диаграммы кромок узла с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом Cytoscape или в качестве тепловых карт с использованием R-кода и инструкций по анализу, включенных в дополнительный материал. На протяжении всего протокола, пользователи должны заботиться, чтобы пипетки точно, вести тщательный учет, и держать образцы холодной во все времена.
Мы использовали МИ, чтобы понять, как пути трансдукции сигнала различают различные типы входных данных и интегрируют информацию из нескольких рецепторов.
