멀티플렉스 동시 면역 침전을 이용한 단백질 상호 작용 네트워크 역학의 정량화

정량적 멀티플렉스 공동 면역 침전물 또는 QMI를 사용하면 미리 정의된 단백질 상호 작용 네트워크에서 수백 개의 이진 상호 작용을 동시에 측정할 수 있습니다. 동일한 lysate에서 동시에 여러 공동 IP를 수행함으로써 생물 정보학 기술은 공동 연관 그룹이 조정 된 방식으로 어떻게 변화하는지 검사 할 수 있습니다. 분석은 개발하는 데 시간이 많이 걸리지만 QMI 패널이 네트워크 스케일에 들어가면 비교적 간단하게 하룻밤 사이에 신호 전달 시스템에 대해 수집할 수 있습니다.

QMI는 96 웰 플레이트에 다른 샘플 및 시약의 정확한 파이펫팅이 필요합니다. 오류를 방지하기 위해 각 분석기를 설정하고 실행할 때주의 깊게 주의해야 합니다. 시료 제제 및 면역 침전을 위해, 얼음에 15 분 동안 프로테아제 와 인산 억제제와 적합한 세제에서 샘플을 lysing하여 시작합니다.

인큐베이션의 끝에서, 멤브레인과 파편을 제거하고 표준 프로토콜에 따라 단백질 농도를 결정하기 위해 상체에 BCA 분석기를 수행하기 위해 샘플을 아래로 회전. 단백질 농도를 정상화한 후 각 클래스당 약 250개의 마그네틱 비드가 포함된 마그네틱 비드 마스터 믹스를 준비합니다. 자기 분리를 사용하여 플라이 P 버퍼에서 두 번 마그네틱 비드 믹스를 세척한 후 샘플당 플라이 P 버퍼 20 마이크로리터에서 구슬을 다시 분리합니다.

철저한 파이펫팅 후, 시료당 20마이크로리터의 비드를 하나의 얼음 냉간 미세센심분리기 튜브에 넣고 면역 침전을 위해 각 튜브에 정규화된 단백질 농도와 동일한 양의 리세이트를 추가합니다. 그런 다음 각 lysate 샘플을 실행하는 각 플레이트에 대해 하나의 튜브로 나누고 빛으로부터 밤새 보호되는 섭씨 4도에서 회전기의 샘플을 면역 침전시합니다. 다음 날 아침, 마그네틱 비드 랙을 사용하여 첫 번째 튜브 세트에서 용액을 제거하고 세척당 얼음 차가운 플라이 P 버퍼 500 마이크로리터에서 구슬을 두 번 세척합니다.

재서스펜션 부피를 계산한 후, 얼음 냉기 P 버퍼의 계산된 부피에서 면역침전염을 회수한다. 부드러운 파이펫팅으로 마그네틱 구슬을 철저히 재연하고 얼음 위에 평평한 바닥 96 웰 플레이트를 가로질러 우물당 25마이크로리터의 구슬을 분배합니다. 다른 96 웰 플레이트에서, 2회 작동 농도로 아티네이트 프로브 항체에 의해 희석한다.

멀티채널 파이펫을 사용하여 각 프로브 항체 희석제 25마이크로리터를 분석 플레이트를 함유한 마그네틱 비드의 적절한 우물에 분배하고 수평 플레이트 셰이커에서 고속으로 흔들어 자기 비드를 혼합하고 재보펜한다. 혼합 후 빛으로부터 보호되는 섭씨 4도에서 1시간 동안 배양 속도를 줄입니다. 인큐베이션이 끝나면 4°C의 마그네틱 플레이트 와셔에 세척당 신선한 플라이 P 버퍼로 플레이트를 세 번 씻습니다.

마지막 세척 후, 플라이 P 버퍼에서 1~200을 희석한 스트렙타비딘 PE의 50 마이크로리터에서 구슬을 재연한다. 혼합물을 흔들고 빛으로부터 보호 30 분 동안 섭씨 4도에서 접시를 배양하기 전에 구슬을 다시 놓습니다. 인큐베이션이 끝나면, 4°C에서 마그네틱 플레이트 와셔에 플라이 P 버퍼로 플레이트를 세 번 세척하고 플라이 P 버퍼의 125 마이크로리터에서 구슬을 재놓습니다.

900 회전에서 1 분 동안 접시를 흔들어 구슬을 철저히 재일시 중단하고 플레이트를 냉장고된 흐름 사이토미터에 로드합니다. 유량 사이토미터 소프트웨어에서 고RP1 대상 설정, 지역당 1, 000개의 비드의 정지 조건 및 80마이크로리터의 샘플 부피를 선택합니다. 중간쯤 에 실행을 일시 중지하고 침전을 방지하기 위해 구슬을 다시 일시 중지합니다.

실행이 끝나면 데이터 파일을 XML 형식으로 내보냅니다. ANC 분석을 수행하려면 ANC 입력 파일을 작성하여 실험 설계의 세부 정보를 반영하고 프로그램을 실행하여 활성 디렉터리에 CSV 파일을 작성합니다. 파일이 조회수로 끝납니다.

csv는 4개의 실험 복제 중 적어도 3개에서 대조군과 실험 조건 사이의 0.05의 거짓 양성 수준에서 현저하게 다른 단백질 공동 협회를 보고합니다. 가중 상관 관계 네트워크 분석을 위해 Mfi로 끝나는 Matlab에 의해 데이터 파일 출력의 열 제목을 붙여 넣습니다. csv는 새로운 스프레드시트의 첫 번째 열에 넣고 실험 적 치료 및 분석할 다른 변수를 위한 실험 횟수 및 치료를 위한 컬럼 실험을 추가합니다.

이 파일을 특성으로 저장합니다. csv 및 오픈 R 스튜디오. 작업 디렉터리를 mfi가 포함된 폴더로 설정합니다.

csv 와 특성. csv 파일, 코드의 섹션을 강조 표시하고 명령 입력을 누르고 주석 명령 파일에 표시된 대로 R 명령을 실행합니다. 각 실험 특성과 크게 상관관계가 있는 가중 상관 관계 네트워크 분석 모듈은 그래픽 파일로 출력되며 각 모듈과의 상호 상관 관계는 CSV 파일로 출력됩니다.

ANC 출력 파일의 각 상호 작용에 대해 CNA에서 해당 상호 작용이 중요한지 확인하고 각 ANC 히트가 CNA 히트인지를 나타내는 새 열을 만듭니다. 값을 변환하여 두 배 변경으로 기록하고 모든 ANC 유니온 CNA 조회의 평균 값을 계산합니다. 마지막으로, 각 ANC 유니온 CNA 히트한 각 ANC 조합 CNA히트를 한 열의 면역 침전 목표, 두 번째 열의 프로브 대상 및 세 번째 열의 접이식 변경 값으로 만듭니다.

이 파일을 네트워크로 Cytoscape로 가져와 노드 에지 다이어그램을 만듭니다. 두 개의 독립적인 통계 적 접근법에 의해 확인된 고신뢰도 단백질 상호 작용은 오픈 소스 소프트웨어, Cytoscape를 사용하여 노드 엣지 다이어그램또는 보충 자료에 포함된 R 코드 및 분석 지침을 사용하여 히트맵으로 시각화됩니다. 프로토콜 전반에 걸쳐 사용자는 파이펫을 정확하게 주의하고, 세심한 기록을 보관하고, 샘플을 항상 차갑게 유지해야 합니다.

우리는 신호 변환 경로가 다른 입력 유형을 구별하고 다중 수용체에서 정보를 통합하는 방법을 이해하기 위해 QMI를 사용했다.