Ультра-производительность жидкой хроматографии создана технология для точного анализа IgG n-гликан Из-за его чувствительности, кажется, и он имеет возможность предоставить конкретную информацию о гликан Этот метод прост в использовании и имеет ряд различных относительно низкой стоимости приращений, высокая воспроизводимость Способность к гликан изомеров. Измерения белка в плазме могут быть привлекательными. в медицине.
также связаны с IgG в гликозной базы и таких и биологических, содержащих население. Вы знаете, что нечистое состояние используется для тестирования IgG в гликанах. На самом деле, он может проверить n-гликан белка.
Это необходимо в кросс-связанных белка двух чистых состояний могут быть применены к белку ИЛИ экспериментальный процесс относительно прост в то время как экспериментальный процесс должен быть стандартизирован. На то, чтобы выработать экспериментальный процесс, уходит три дня, а экспериментальные шаги необходимо запомнить, чтобы овладеть экспериментальными навыками. Чтобы подготовить образцы, оттаивать замороженный образец плазмы.
Затем центрифуга 80 раз G в течение 10 минут. Оставьте монолитную пластину белка G при комнатной температуре на 30 минут. Перенесите 100 микрометров образца в каждую колодец двухми миллилитровой пластины коллекции.
Добавьте ультра чистую воду в качестве одного образца управления. Разбавить образцы одним X PBS на один-семь томов по соотношению объема. Очистите 0,45 микрон гидрофильной полипрополеновой фильтровальной пластины с 200 микролитров ультра чистой воды.
Повторите очистку еще два раза. Перенесите разбавленные образцы в фильтровальную пластину и отфильтруйте образцы в коллективную пластину с помощью вакуумного насоса с давлением от 266,6 до 399,9 паскаля. Чтобы подготовить монолитные пластины белка G, сначала отбросьте буфер хранения.
Очистите монолитные пластины с двумя миллилитров ультра чистой воды, два миллилитров одного X PBS, один миллилитр 0,17 моларной миновой кислоты, два миллилитров 10 X PBS, и два миллилитров одного X PBS последовательно. Удалите следующую жидкость с помощью вакуумного насоса. Используя многоканальный пипетку, перенесите отфильтрованные образцы на монолитную пластину белка G для связывания и очистки IgG.
Затем добавьте два миллилитров одного X PBS для очистки монолитных пластин. Удалите PBS с помощью вакуумного насоса, и повторить очистку два дополнительных раза. Illute IgG с одним миллилитром 0,17 молярной миновой кислоты, и фильтровать образцы в пластину сбора вакуумным насосом.
Затем добавьте в коллекцию 170 микролитров одного двухкармония молярного бикарбоната. Обнаружите концентрацию IgG с помощью спектротропетометра поглощения на оптимальной длине волны 280 нанометров. Поместите извлеченный IgG в духовку, чтобы высохнуть при температуре 60 градусов по Цельсию в течение трех часов.
Определите количество наблюдаемого в соответствии с его концентрацией, описанное в рукописи, и сохраните его при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Соберите сушеные IgG, и хранить химические вещества, включая 1,33%SDS, четыре процента IgePal и 5%PBS при комнатной температуре. Приготовьте фермент indoglycosidase F, разбавляя 250 единиц фермента 250 микролитров ультра чистой воды.
Чтобы денатуратура IgG, добавить 30 микролитров 1.33%SDS и смешать вихрем. Перенесите образец в духовку по Цельсию на 65 градусов в течение 10 минут. Затем вынюйте его из духовки и дайте ему остыть в течение 15 минут.
Добавьте 10 микролитров четырехпроцентного IgePal в тот же образец и поместите его на трясусь инкубатор в течение пяти минут. Добавьте 20 микролитров пяти X PBS и от 30 до 35 микролитров 0,1 молярного гидроксида натрия, чтобы регулировать рН до 8,0, и смешайте вихрем. Добавьте четыре микролитров фермента эндогликозидазы F и перемешайте вихрем.
Затем инкубировать в течение 18 до 20 часов в 37 градусов по Цельсию водяной бане. На следующий день поместите освобожденных гильцов в духовку при температуре 60 градусов по Цельсию, чтобы высохнуть в течение двух с половиной-трех часов. Сохранить релиз гликанов при температуре минус 80 градусов по Цельсию до дальнейшего измерения.
Приготовьте два аминокислотных бензимида, маркированных реагентом с 24,5 микролитров DMSO, 10,5 микролитров уксусной кислоты, 0,7 миллиграмма двух аминоцинзимида и шесть миллиграммов цианоборогидрида натрия. Далее, в темной комнате, этикетка гликанов, добавив 35 микролитров двух аминокислот бензимида маркировки реагента. Перенесите помеченные глюканы на осциллятор в течение пяти минут, а затем перенесите его в духовку на три часа при температуре 65 градусов по Цельсию.
После этого перенесите его на комнатную температуру на 30 минут. IgG n-glycase, мы будем маркировать его, чтобы быть обнаружены флуоресцентные обнаружения нечистого состояния. Предварительно обработать 0,2 микрон GHP фильтр пластины с 200 микролитров 70% этанола, 200 микролитров ультра чистой воды, и 200 микролитров 96%aceto nitrile при четырех градусах цельсия.
Затем удалите отходы с помощью вакуумного насоса. Чтобы очистить два аминокислоты бензимида помечены гликанами, добавить 700 микролитров 100%ацетонитрил в образец, и передать его в трясущимся инкубатором в течение пяти минут. Центрифуга при 134 градусах G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.
Перенесите супернатант на 0,2 микрона GHP фильтр пластины в течение двух минут, и удалить фильтр с помощью вакуума. Вымойте два аминокислоты бензимида помечены гликан с 200 микролитров 96%acetonitrile при четырех градусах по Цельсию, и удалить фильтрат с помощью вакуумного насоса пять-шесть раз. Illute два аминокислоты бензимида помечены гликан с 100 микролитров ультра чистой воды в три раза.
Передача двух аминокислот бензимида помечены гликан в духовку, чтобы высохнуть при температуре 60 градусов по Цельсию в течение трех с половиной часов. Сохранить помечены n-гликанов при температуре минус 80 градусов по Цельсию до дальнейшего измерения. Во-первых, откройте программное обеспечение для управления мобильными фазами.
Вымойте инструменты UPLC с 50%solvent B и 50%solvent C при скорости потока 0,2 миллилитров в минуту в течение 30 минут. Затем промойте 25%solvent A и 75%solvent B со скоростью потока 0,2 миллилитров в минуту в течение 20 минут. Затем добавьте скорость потока 0,4 миллилитров в минуту.
Растворите помеченные n-гликаны с 25 микролитров смеси 100%ацетонитрила и ультра чистой воды при двух к одному объему по соотношению объема. Затем центрифуга при 134 градусах G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, и использовать сухую трубу для загрузки 10 микролитров супернатента в инструменты UPLC. Разделите помеченные n-гликаны со скоростью потока 0,4 миллилитров в минуту с линейным градиентом от 75%до 62%ацетонитриля в течение 25 минут.
Затем выполните аналитический запуск гликопептидной колонки dexteran calibration ladder на UPLC при 60 градусах по Цельсию. Обнаружить n-гликан флуоресцентные лампы на X цитирования и выбросов длин волн 330 нанометров и 420 нанометров, соответственно. Как показано на этом рисунке, IgG n-гликаны были проанализированы в 24 первоначальных пиков IgG гликан на основе пикового положения и времени удержания.
Структуры n-гликан доступны в 24 типах с помощью обнаружения масс-спектрометрии. Чтобы ослов повторяемость и стабильность метода, стандартный образец был протестирован параллельно шесть раз. Пики гликан с относительно небольшими пропорциями показали высокие ошибки измерения более 10% коэффициента вариации.
В части и важно для формирования установленных IgG n-гликан структуры, особенно для создания терминала Поэтому, вместо 3,3 IgG n-glycase найти в имеет решающее значение в этом важность IgG. Гликаны от, как известно, разные. С развитием гликан прототомии, в сочетании с гликанами, чтобы изучить информацию к этому так, что он может быть использован в качестве потенциала для сегодняшнего диагноза.
После разработки этого метода, он предоставляет новый способ изучения
