Chromatographie liquide ultra-performante est une technologie établie pour l’analyse précise de l’IgG n-glycan En raison de sa sensibilité semble être et il a la capacité de fournir une information spécifique de glycan Cette méthode est facile à utiliser et a un certain nombre de différents coûts relativement faibles d’incréments, une reproductibilité élevée La capacité d’isomères glycan. Les mesures des protéines dans le plasma pourraient être attrayantes. en médecine.
également associé à l’IgG dans la base de glycose et tel et biologique contenant la population. Vous savez que de l’état impur est utilisé pour tester IgG en glycanes. En fait, il peut tester n-glycanes de protéines.
Ceci est nécessaire dans une protéine croisée de deux états purs peut être appliquée à la protéine Le processus expérimental or est relativement simple tandis que le processus expérimental doit être normalisé. Le processus expérimental de bout en bout prend trois jours pour fonctionner, et les étapes expérimentales doivent être mémorisées afin de maîtriser les compétences expérimentales. Pour préparer les échantillons, décongeler l’échantillon de plasma congelé.
Puis, centrifugeuse à 80 fois G pendant 10 minutes. Laisser la plaque monolithique en protéines G à température ambiante pendant 30 minutes. Transférer 100 micromètres d’échantillon dans chaque puits de la plaque de collecte de deux millilitres.
Ajouter de l’eau ultra pure comme échantillon de contrôle. Diluer les échantillons avec un X PBS par un à sept volume par rapport au volume. Nettoyez une plaque de filtre hydrophilique polypropolene de 0,45 micron avec 200 microlitres d’eau ultra pure.
Répétez le nettoyage deux fois de plus. Transférer les échantillons dilués dans la plaque de filtre et filtrer les échantillons dans la plaque collective à l’aide d’une pompe à vide avec pression de 266,6 à 399,9 Pascals. Pour préparer les plaques monolithiques de protéine G, jetez d’abord le tampon de stockage.
Nettoyez les plaques monolithiques avec deux millilitres d’eau ultra pure, deux millilitres d’un X PBS, un millilitre de 0,17 molaire acide formique, deux millilitres de 10 X PBS, et deux millilitres d’un X PBS séquentiellement. Retirer le liquide suivant à l’aide d’une pompe à vide. À l’aide d’un pipet multicanal, transférer les échantillons filtrés à la plaque monolithique de protéine G pour la liaison et le nettoyage IgG.
Ensuite, ajoutez deux millilitres d’un X PBS pour nettoyer les plaques monolithiques. Retirez le PBS à l’aide d’une pompe à vide et répétez le nettoyage deux fois de plus. Illute IgG avec un millilitre d’acide formic molaire de 0,17, et filtrer les échantillons dans la plaque de collecte par pompe à vide.
Ajouter ensuite 170 microlitres d’un bicarbonate d’ammonium molaire dans la plaque de collecte. Détecter la concentration d’IgG à l’aide d’un spectropétomètre d’absorption à la longueur d’onde optimale de 280 nanomètres. Placer l’IgG extrait dans un four pour sécher à 60 degrés Celsius pendant trois heures.
Déterminez la quantité à observer en fonction de sa concentration telle que décrite dans le manuscrit et conservez-la à moins 80 degrés Celsius. Recueillir l’IgG séché, et stocker des produits chimiques, y compris 1,33%SDS, quatre pour cent IgePal et 5%PBS à température ambiante. Préparer l’enzyme Indoglycosidase F en diluant 250 unités d’enzymes avec 250 microlitres d’eau ultra pure.
Pour dénoter l’IgG, ajouter 30 microlitres de 1,33% SDS et mélanger par vortex. Transférer l’échantillon dans un four de 65 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, retirez-le du four et laissez-le refroidir pendant 15 minutes.
Ajouter 10 microlitres de quatre pour cent IgePal dans le même échantillon, et le placer sur un incubateur secouant pendant cinq minutes. Ajouter 20 microlitres de cinq X PBS et 30 à 35 microlitres d’hydroxyde de sodium molaire de 0,1 molaire pour réguler le pH à 8,0, et mélanger par vortex. Ajouter quatre microlitres d’enzyme endoglycosidase F, et mélanger par vortex.
Puis, incuber pendant 18 à 20 heures dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius. Le lendemain, placer les gylcans libérés dans un four à 60 degrés Celsius pour les sécher de deux heures et demie à trois heures. Économisez les glycanes de libération à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce que d’autres mesures.
Préparer les deux aminés benzimide étiquetant le reagent avec 24,5 microlitres de DMSO, 10,5 microlitres d’acide acétique, 0,7 milligramme de deux benzimides aminés et six milligrammes de cyanoborohydride de sodium. Ensuite, dans une pièce sombre, étiqueter les glycanes en ajoutant 35 microlitres de deux benzimides aminés étiquetant le reagent. Transférer les glcans étiquetés dans un oscillateur pendant cinq minutes, puis le transférer au four pendant trois heures à 65 degrés Celsius.
Après cela, le transférer à température ambiante pendant 30 minutes. L’IgG n-glycase, nous allons l’étiqueter avec afin d’être détecté par la détection fluorescente de l’état impur. Prétraitez une plaque filtrante GHP de 0,2 micron avec 200 microlitres de 70% d’éthanol, 200 microlitres d’eau ultra pure et 200 microlitres de nitrile d’aceto à 4 degrés Celsius.
Ensuite, retirez les déchets à l’aide d’une pompe à vide. Pour purifier les deux glycanes étiquetés benzimide aminé, ajouter 700 microlitres de 100% acétyltrile à l’échantillon, et le transférer dans un incubateur de secousses pendant cinq minutes. Centrifugeuse à 134 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Transférer le supernatent dans une plaque de filtre GHP de 0,2 microns pendant deux minutes et retirer le filtrate à l’aide du vide. Lavez les deux benzimides aminés étiquetés glycan avec 200 microlitres de 96% d’acétylonitrile à quatre degrés Celsius, et retirez le filtrate à l’aide d’une pompe à vide cinq à six fois. Illute deux benzimides aminés étiquetés glycan avec 100 microlitres d’eau ultra pure trois fois.
Transférer les deux benzimides aminés étiquetés glycan dans un four pour sécher à 60 degrés Celsius pendant trois heures et demie. Économisez les n-glycans étiquetés à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce que d’autres mesures soient. Tout d’abord, ouvrez le logiciel pour contrôler les phases mobiles.
Lavez les instruments UPLC avec 50 % de solvant B et 50 % de solvant C au débit de 0,2 millilitres par minute pendant 30 minutes. Ensuite, lavez-le avec 25 % de solvant A et 75 % de solvant B à un débit de 0,2 millilitres par minute pendant 20 minutes. Ajouter ensuite un débit de 0,4 millilitres par minute.
Dissoudre les n-glycans étiquetés avec 25 microlitres d’un mélange de 100% d’acétylonitrile et d’eau ultra pure à un rapport volume/volume de deux pour un. Ensuite, centrifugeuse à 134 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, et utiliser un tuyau sec pour charger 10 microlitres du supernatent dans les instruments UPLC. Séparez les n-glycans étiquetés à un débit de 0,4 millilitres par minute avec un gradient linéaire de 75% à 62% d’acétyonitrile pendant 25 minutes.
Ensuite, effectuez une analyse dirigée par Dexteran étalonnage échelle colonne glycopeptide sur un UPLC à 60 degrés Celsius. Détecter les fluorescents n-glycan à la citation X et les longueurs d’onde d’émission de 330 nanomètres et 420 nanomètres, respectivement. Comme indiqué dans ce chiffre, IgG n-glycans ont été analysés en 24 pics glycan IgG initiaux basés sur la position de pointe et le temps de rétention.
Les structures n-glycan sont disponibles en 24 types grâce à la détection de spectrométrie de masse. Pour asses la répétabilité et la stabilité de la méthode, l’échantillon standard a été testé en parallèle six fois. Les pics glycan avec des proportions relativement faibles ont montré des erreurs de mesure élevées de plus de 10% du coefficient de variation.
Dans la pièce et important de former à un établi de la structure IgG n-glycan, en particulier pour l’établissement terminal Par conséquent, au lieu de 3,3 IgG n-glycase trouvé dans est critique en ce que l’importance de l’IgG. Glycans de sont connus pour être différents. Avec les développements en prototomique glycan, combiné en glycanes pour explorer l’information à ce point qu’il peut être utilisé comme un potentiel pour le diagnostic d’aujourd’hui.
Après ce développement technique, il offre une nouvelle façon d’explorer
