초고성능 액체 크로마토그래피는 IgG n-글리칸의 정확한 분석을 위한 기술이 확립되어 있어 민감성이 높고 글리칸의 특정 정보를 제공할 수 있는 능력이 있어 사용하기 쉽고 상대적으로 낮은 증분, 높은 재현성, 높은 재현성 의 수의 이소마저에 대한 능력이 있다. 플라즈마에서 단백질의 측정은 매력적일 수 있습니다. 의학에서.
또한 글리코제 염기 및 인구를 포함하는 이러한 및 생물학적 제제에서 IgG와 연관. 불순한 상태의 글리칸에서 IgG를 테스트하는 데 사용된다는 것을 알고 있습니다. 실제로, 그것은 단백질의 n-글리칸을 테스트할 수 있습니다.
이는 2개의 순수한 상태의 교차 결합 단백질에서 필요하며, 실험 공정이 표준화되어야 하는 동안 OR 실험 공정이 비교적 간단하다단백질에 적용될 수 있다. 종단 간 실험 과정은 작동하는 데 3 일이 걸리며 실험 기술을 습득하기 위해 실험 단계를 암기해야합니다. 샘플을 준비하려면 냉동 플라즈마 샘플을 해동하십시오.
그런 다음 원심 분리기는 80 배 G에서 10 분 동안. 단백질 G 모놀리식 플레이트를 실온에서 30분 동안 그대로 둡니다. 2밀리리터 수집 플레이트의 각 우물에 100 마이크로미터의 샘플을 전달합니다.
하나의 제어 샘플로 초순수수를 추가합니다. 1개의 X PBS로 샘플을 부피 비율로 1~7부씩 희석합니다. 0.45 마이크로론 수성 성수기 폴리프로폴렌 필터 플레이트를 200 마이크로리터의 초순수 수로 청소하십시오.
청소를 두 번 더 반복합니다. 희석된 샘플을 필터 플레이트로 옮기고, 266.6 내지 399.9 파스칼의 압력을 가진 진공 펌프를 사용하여 샘플을 집단 판으로 필터링한다. 단백질 G 모놀리식 플레이트를 준비하려면 먼저 저장 버퍼를 폐기하십시오.
초순수 수분 2밀리리터, X PBS 2개, 어금니 포름산 1밀리리터, 10X PBS 2개, X PBS 1개 밀리리터 2개 순차적으로 모놀리식 플레이트를 청소합니다. 진공 펌프를 사용하여 다음 액체를 제거합니다. 멀티채널 파이프를 사용하여 여과된 샘플을 IgG 결합 및 세척을 위한 단백질 G 모놀리식 플레이트로 전달합니다.
그런 다음 한 개의 X PBS의 밀리리터 2개를 추가하여 모놀리식 플레이트를 청소합니다. 진공 펌프를 사용하여 PBS를 제거하고 청소를 두 번 더 반복합니다. 0.17 의 1 밀리리터의 0.17 어금니 포름산으로 일루트 IgG, 진공 펌프에 의해 수집 판으로 샘플을 필터링.
그런 다음, 수집 판에 1개의 어금다 암모늄 중탄산염170마이크로리터를 추가합니다. 280 나노미터의 최적 파장에서 흡수 스펙로프토미터를 사용하여 IgG 농도를 감지합니다. 추출된 IgG를 오븐에 넣고 섭씨 60도에서 3시간 동안 건조시다.
원고에 설명된 바와 같이 농도에 따라 관찰되는 양을 결정하고 영하 80도에서 보존한다. 말린 IgG를 수집하고 실온에서 1.33 % SDS, 4 % IgePal 및 5 %PBS를 포함한 화학 물질을 저장합니다. 250 마이크로리터의 초순수수로 250단위의 효소를 희석하여 인독리코시다아제 F 효소를 준비하십시오.
IgG를 분해하려면 1.33%의 SDS의 마이크로리터 30기를 추가하고 소용돌이로 혼합합니다. 샘플을 섭씨 65도 오븐으로 10분간 옮김합니다. 그런 다음 오븐에서 꺼내 서 15 분 동안 식힙니다.
동일한 샘플에 4%의 IgePal의 마이크로리터 10개를 추가하고 흔들리는 인큐베이터에 5분간 놓습니다. 5개의 X PBS와 30~35마이크로리터의 마이크로리터를 추가하여 0.1 의 어금니 나트륨 수산화나트륨을 추가하여 pH를 8.0으로 조절하고, 소용돌이에 섞는다. endoglycosidase F 효소의 4 개의 마이크로 리터를 추가하고, 소용돌이에 의해 혼합.
그런 다음 섭씨 37도의 수조에서 18~20시간 동안 배양합니다. 다음 날, 방출 된 질칸을 오븐에 60섭씨 60도에 놓고 2 시간 반에서 3 시간 동안 건조하십시오. 추가 측정이 될 때까지 방출 글리칸을 영하 80도에서 절약하십시오.
2개의 아미노 벤지미드 라벨링 시약은 DMSO 24.5 마이크로리터, 아세트산 10.5 마이크로리터, 아세트산 10.5마이크로리터, 2개의 아미노 벤지미드의 0.7 밀리그램, 그리고 시아노보로하이드라이드 나트륨 6밀리그램을 준비합니다. 다음으로, 어두운 방에서, 두 개의 아미노 벤지미드 라벨 시약의 35 마이크로 리터를 추가하여 글리칸을 라벨. 라벨이 부착된 글랜캔을 발진기로 5분간 옮은 다음, 섭씨 65도에서 3시간 동안 오븐으로 옮기습니다.
그 후, 30 분 동안 실온으로 전송합니다. IgG n-glycase는 불순한 상태의 형광 검출에 의해 검출되기 위해 라벨을 붙일 것입니다. Pretreat는 70%에탄올20마이크로리터, 초순수 수분 200마이크로리터, 96%의 아세토 니트리어 200마이크로리터를 섭씨 4도에 장착한 0.2 마이크로론 GHP 필터 플레이트를 제공합니다.
그런 다음 진공 펌프를 사용하여 폐기물을 제거합니다. 두 개의 아미노 벤지미드 라벨 글리칸을 정화하려면 100% 아세토닐릴의 700 마이크로리터를 샘플에 넣고 흔들리는 인큐베이터로 5분 간 옮김합니다. 섭씨 4도에서 5분간 134회 G의 원심분리기.
수퍼네텐트를 0.2미크론 GHP 필터 플레이트로 2분간 전송하고 진공을 사용하여 여과물을 제거한다. 아미노 벤지미드 라벨이 부착된 글리칸 2개를 섭씨 4도에서 96%의 아세토닐트리어200마이크로리터로 세척하고 진공 펌프를 사용하여 5~6회 여과물을 제거합니다. 아미노 벤지미드 라벨 글리칸 2개에 100마이크로리터의 초순수수 3회.
라벨이 붙은 두 개의 아미노 벤지미드 글리칸을 오븐에 넣고 섭씨 60도에서 3시간 반 동안 건조시다. 라벨이 부착된 n-글리칸을 추가 측정전까지 영하 80도에서 저장하십시오. 먼저 소프트웨어를 열어 모바일 단계를 제어합니다.
UPLC 계측기를 50%의 용매 B와 50%의 용매 C로 분당 0.2 밀리리터의 유량으로 30분간 세척합니다. 그런 다음 분당 0.2 밀리리터의 유량으로 25%의 용매 A와 75%의 용매 B로 20분 간 세척합니다. 그런 다음 분당 0.4 밀리리터의 유량을 추가합니다.
라벨이 부착된 n-글리칸을 100%의 아세토닐릴과 초순수수를 2대 1부피 비율로 혼합하여 25마이크로리터로 녹입니다. 그런 다음, 원심분리기는 섭씨 4도에서 5분 동안 134회 G로 원심분리기를 사용하고, 드라이 파이프를 사용하여 SUPERNATENT 의 10 마이크로리터를 UPLC 기기에 적재합니다. 라벨이 부착된 n-글리칸을 분당 0.4 밀리리터의 유량으로 분리하여 25분 동안 75%에서 62%의 아세토니틀을 선형 그라데이션으로 분리합니다.
그런 다음 UPLC에서 덱스터란 교정 사다리 글리코펩티드 컬럼이 섭씨 60도에서 실행한 분석을 수행합니다. 각각 330나노미터 및 420나노미터의 X 인용 및 방출 파장에서 n-글리칸 형광을 검출한다. 본 그림과 같이, IgG n-글리칸은 피크 위치 및 보존 시간을 기준으로 24개의 초기 IgG 글리칸 피크로 분석되었다.
n-글리칸 구조는 질량 분석 검출을 통해 24가지 유형으로 제공됩니다. 방법의 반복성 및 안정성을 asses하기 위해 표준 샘플을 6 번 병렬로 테스트했습니다. 상대적으로 작은 비율을 가진 글리칸 피크는 변동계수의 10% 이상의 높은 측정 오차를 보였다.
이 조각에서 IgG n-글리칸 구조의 확립된 형성에 중요한 것은, 특히 말단을 확립하기 위해, 3.3 IgG n-glycase 대신에 IgG의 중요성이 중요하다. 글리칸에서 온 글리칸은 다른 것으로 알려져 있습니다. 글리칸 프로토믹의 발전과 함께 글리칸에 결합하여 오늘날의 진단의 잠재력으로 사용될 수 있도록 정보를 탐구합니다.
이 기술 개발 후, 그것은 탐구하는 새로운 방법을 제공합니다
