Этот протокол позволяет производство мутагенизированных гаплоидных конечностей, которые могут быть использованы для генетического скрининга в аксолотле. При гаплоидах даже низкоуровневый мутагенез может привести к потере фенотипов функции в клетках. Этот метод прививки также может быть использован для спасения эмбриональных смертельных фенотипов.
Этот метод может быть использован для изучения регенерации в любых видах земноводных, которые подменяются экстракорпорального оплодотворения и прививки. Перед использованием гаплоидных эмбрионов в качестве доноров, мы рекомендуем практиковать и подтверждать успех трансплантатов между GFP положительных и отрицательных диплоидных эмбрионов. Для женской подготовки донора gamete, анестезировать сексуально зрелый белый или белый RFP женский аксолотль, чтобы служить в качестве донора gamete.
После подтверждения отсутствия реакции на моделирование боли, использовать 30 калибровочный инсулин шприц для введения 0,15 миллилитров человека хорионический гонадотропин в мускулатуру спинной к задней конечности. Вставьте шприц под углом 45 градусов к средней линии, чтобы избежать контакта со спинным мозгом. Поместите инъекционной животных в свежем растворе 40%Holtfreter и передать аксолотль в 8 до 12 градусов по Цельсию холодильник в течение 48 часов.
Затем верните самку к комнатной температуре. В то время как самка откладывает яйца, поместите полностью анестезированого самца в положение на спине на влажных бумажных полотенцах под рассекающий микроскоп и располагайте кончик пипетки P1000 у основания клоаки доминирующей рукой. Поместите другой указательный палец и большой палец от двух до трех сантиметров рострального к тазу и осторожно сжать животное при перемещении пальцев к задним ногам, чтобы избавиться от образцов спермы мочи сбора каждого образца в новую трубку микроцентрифуг.
Затем перенесите пять микролитров из каждого образца в чашку Петри, чтобы проверить качество спермы с помощью перевернутого микроскопа. После подсчета, разбавить сперму до концентрации восемь раз 10 до четвертого клетки на миллилитр в 0,1X стерильных MMR и передачи 0,5 микролитров сперматозоидов на яйцо в новую чашку Петри. Затем используйте наконечник пипетки, чтобы распространить подвеску на слой толщиной в один миллиметр и использовать пластиковый лифт, чтобы поместить образец в четырех сантиметрах от ламп 254 нанометрового кросслинкера для облучения в восемь раз от 10 до пятого микроджоуля на миллиметр в квадрате.
После сбора здорового образца спермы, поместите самку в положение на спине на стопку влажных бумажных полотенец и использовать аналогичные промывки движения для извлечения неоплодотвореных яйцеклеток из женского аксолотля. Затем используйте влажные типсы, чтобы перевести яйца в 10-сантиметровую чашку Петри. В течение 15 минут после сбора, используйте P10 пипетку, чтобы обойтись облученной спермы на неутилизованных яйцеклеток покрытие каждой яйцеклетки с 0,25 до 0,5 микролитров инактивированной спермы.
После разрешения яйца сидеть при комнатной температуре в течение 30 минут, затопить яйца с 0.1X MMR. Тридцать минут после гидратации, использовать острые миппы, чтобы dejelly яйца и место яйца при 18 градусов по Цельсию для микроинъекции в течение семи часов. Для генерации гаплоидно-диплоидной химеры поместите одного здорового гаплоидного донора с одной или двумя стадиями, сопостановившимися с GFP положительными эмбрионами-диплоидными хостами внутри корыта предварительно охлажденной операционной тарелки, содержащей хирургическую среду на 10 градусов по Цельсию или нижней стадии охлаждения.
Используйте два ультра тонкой autoclaved прямой кончик тибры, чтобы удалить весь бутон конечностей и окружающих эктодермов и мезодерм слоев ткани и выделить ткани хозяина. Удалите оболочку ткани эквивалентного размера из гаплоидного донора и поместите гаплоидную оболочку донорской ткани на соответствующую область эмбриона хозяина. Закрепить ткань автоклавом прямоугольного стеклянного осколка из измельченного микроскопа крышкой и аккуратно прижимать ткань к телу эмбриона хозяина.
Оставьте якорь на месте в течение 60 до 75 минут проверки каждые 20 минут, чтобы подтвердить, что стекло не поскользнулся перед использованием типса, чтобы снять фрагмент стекловолокна. Перенесите присвяченные эмбрионы в свежую хирургическую среду, позволяющую им исцелиться при 8-12 градусах Цельсия за одну ночь до того, как они будут обуславлены эмбрионами индивидуально в 12 или 24-х пластинах. 38,7% яйцеклеток превратились в нормально развитые гаплоидные эмбрионы.
На стадии трансплантата гаплоидные эмбрионы обладают уменьшенной кривизной вдоль передней-задней оси и неполным корпусом желтковой пробки. Кроме того, флуоресцентный микроскоп может быть использован для подтверждения гаплоидных эмбрионов, свободных от выражения GFP по отцовской линии. Неудачные и нечистые трансплантаты производят различные фенотипы.
Когда трансплантаты чисты и нормально разработаны, выражение GFP должно быть ограничено главным образом брахиальным сплетением, нейронной сетью, полученной из спинного мозга хозяина. ПунктаТ GFP выражение также присутствует в одиночных клетках, которые, как представляется, сенсорные нейроны в крови полученных клеток-хозяй, которые мигрируют в развивающейся конечности. Когда RFP положительные доноры используются, гаплоидных трансплантатных конечностей демонстрируют универсальное выражение RFP.
На протяжении всего развития, немутагенизированные гаплоидные конечности значительно короче, чем противоположные диплоидные конечности у химерных животных. Немутагенизированные гаплоидные конечности полностью регенерируют, хотя они демонстрируют небольшую задержку в достижении цифровой стадии нарости по сравнению с диплоидами. Не забудьте использовать стерильную технику и полностью удалить и заменить полный мезодерм и эктодерм слоев ткани из эмбрионального хозяина для того, чтобы произвести чисто привитой конечности.
Мутант конечностей могут быть ампутированы и забил для регенерации фенотипов. Мутантные аллели можно количественно оценить с помощью последовательности следующего поколения. В сочетании с CRISPR-Cas9 mutagenesis, наша техника прививки позволила нам провести отрицательный экран отбора целевых генов в регенерации гаплоидных конечностей.
