Этот протокол для определения размера расплода и эмбриональной жизнеспособности используется многими лабораториями C.elegans. Уменьшение грубых размеров и эмбриональной жизнеспособности может указывать на дефекты в важных процессах развития, таких как миоз, оплодотворение и эмбриогенез. Эта методика дает четкие инструкции для начинающих исследователей C.elegans.
Он относительно прост в настройке и выполнении и является отличной отправной точкой при работе с новыми мутантными штаммами. Самой большой проблемой для этого метода является идентификация эмбриона по сравнению с неоплодотворенным эмбрионом. Новые исследователи должны практиковать идентификацию эмбрионов, ооцитов и различных личиночных стадий, прежде чем начинать эти эксперименты.
Для начала пометьте заднюю часть тарелки, перенесите на тарелку отдельный гермафродит стадии L4. Убедитесь, что эмбрионы или другие черви не переносятся на тарелку. Дайте червям развиться во взрослых особей и отложите самостоятельное потомство в течение 24 часов при стандартной температуре выращивания 20 градусов по Цельсию.
Забейте тарелку на третий день. На следующий день пометьте набор новых пластин и перенесите на новую тарелку одного отдельного червячка. Дайте червям отложить эмбрионы в течение 24 часов при температуре 20 градусов по Цельсию.
Забейте тарелку на четвертый день. На третий день пометьте набор новых тарелок и перенесите на новую тарелку отдельных червей второго дня. Дайте червям отложить потомство в течение 24 часов при температуре 20 градусов.
Забейте тарелку на пятый день. Нарисуйте узор сетки на 35-миллиметровой крышке мелким маркером. Поместите решетчатую крышку под тестовую пластину для подсчета, чтобы отслеживать ранее подсчитанных червей.
Используя дифференциальный счетчик клеток, подсчитайте живых личинок и невылупившихся эмбрионов в пределах отдельного квадрата. Для червей на квадратных границах подсчитайте исходя из расположения головы червя. Посчитайте червей с головами, касающимися верхнего и левого краев квадрата.
Запишите количество живых личинок и невылупившихся эмбрионов в лабораторную тетрадь. На четвертый день подсчитайте тарелку второго дня, подсчитав живых личинок и невылупившиеся эмбрионы, и запишите их в лабораторную тетрадь. На пятый день подсчитайте тарелку третьего дня, подсчитав живых личинок и невылупившиеся эмбрионы, и запишите их в лабораторную тетрадь.
После маркировки обратной стороны пластины перенесите на пластину отдельного червя-гермафродита L4. Убедитесь, что эмбрионы или другие черви не переносятся на тарелку. Перенесите одного червя-самца L4 на пластину, содержащую гермафродита L четыре.
Дайте червям спариться и отложить потомство в течение 24 часов при температуре 20 градусов по Цельсию. Оцените тарелку на наличие живых личинок по сравнению с невылупившимися эмбрионами на третий день. На следующий день пометьте набор новых тарелок и перенесите гермафродита и самца на новую тарелку.
Следите за тем, чтобы гермафродит достиг совершеннолетия. Дайте гермафродитам отложить потомство в течение 24 часов при температуре 20 градусов по Цельсию. Оцените тарелку на наличие живых личинок по сравнению с невылупившимися эмбрионами на четвертый день.
На третий день пометьте набор новых тарелок и перенесите гермафродита и самца на новую тарелку. Дайте червям отложить потомство в течение 24 часов при температуре 20 градусов. Оцените тарелку для живых и невылупившихся эмбрионов на пятый день.
Используя дифференциальный счетчик клеток, подсчитайте живых личинок и невылупившихся эмбрионов с первого дня и запишите их в лабораторную тетрадь. На четвертый день подсчитайте живое потомство и невылупившиеся эмбрионы со второго дня и запишите их в лабораторную тетрадь. Проверьте тарелку первого дня для мужчин.
Если спаривание произошло, ожидаемое генетическое соотношение гермафродитов и самцов составляет 50 к 50. Если в первый день на тарелке нет ни одного самца, спаривания между самцом и гермафродитом не происходило. Откажитесь от этой брачной пары и запишите наблюдение в лабораторную тетрадь.
На пятый день подсчитайте живых личинок и невылупившиеся эмбрионы с третьего дня и запишите их в лабораторную тетрадь. Анализ эмбриональной жизнеспособности для N2 дал процент жизнеспособности 98,9%, в то время как и him-5 (e1490), и spo-11 (ok79) показали снижение эмбриональной жизнеспособности с процентом 74,9% и 0,8% соответственно. Средний размер выводка N2, him-5(e1490) и spo-11(ok79) был определен как 217, 105 и 219 соответственно.
Распознавание различных стадий развития C.elegans важно для точных и воспроизводимых данных. Мы рекомендуем ознакомиться с развитием червя с помощью изображений и препарирующего микроскопа. Эта процедура является отличным первым шагом для определения того, участвует ли ген в процессе развития, и за ней могут последовать цитологические анализы, чтобы определить, какой процесс нарушен.
