Этот протокол помогает идентифицировать мутации, которые происходят во время восстановления двухцепочечного разрыва, индуцированного однонаправленной РНК и CAS9. Основным преимуществом этого метода является то, что он является экономически эффективным и надежным способом обнаружения мутаций в определенном геномном локусе. В качестве примера мы используем кератиноцит человека, но этот протокол может быть адаптирован к любым трансфектируемым клеточным линиям.
Демонстрировать этот протокол будет Тейлор Багби, ассистент бакалавриата из нашей лаборатории. Для начала культивируем клетки HFK LXSN и HFK 8E6 в 10-сантиметровые пластины при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом в оболочке инкубатора, содержащей питательные среды кератиноцитов с добавкой для роста кератиноцитов человека и 1% пенициллина стрептомицина. Замените питательные среды тремя миллилитрами трипсина-ЭДТА и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение трех минут.
Затем нейтрализуют трипсин равным объемом среды, дополненной FBS. Теперь перенесите ячейки в 15-миллилитровую центрифужную трубку и центрифугу в 300 раз G в течение пяти минут. Повторно суспендировать клетки с 10 миллилитрами питательных сред кератиноцитов с добавкой для роста кератиноцитов человека и определять концентрацию клеток с помощью гемоцитометра.
После этого по две пластины для клеток HFK LXSN и HFK 8E6 в четыре миллилитра культуральной среды кератиноцитов с добавкой для роста кератиноцитов человека и 1% пенициллином стрептомицином. После посева инкубируйте клетки при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в инкубаторе рубашки. В день трансфекции замените среду тремя миллилитрами безантибиотиков и инкубируйте в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе рубашки.
Чтобы трансфектировать клетки, согрейте трансфекционные реагенты до комнатной температуры и аккуратно пипетите их перед использованием. Поместите соответствующее количество трансфекционного буфера в две стерильные 1,5-миллилитровые центрифужные трубки для каждой клеточной линии и пометьте их как трубку одну и имитацию трансфекции или трубку две. Затем добавьте два микрограмма плазмидной ДНК-экспрессирующей, CAS9, одноруководной, нацеленной на РНК человека CD4 в трубку один и пипетку осторожно, чтобы полностью перемешать.
Добавьте равный объем стерильной воды в трубку две. Добавьте соответствующее количество трансфекционного реагента в трубку с днк-смесью и имитацией трансфекции или трубкой два. Используя пипетку, аккуратно перемешайте их полностью и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15-30 минут, чтобы сформировать комплексы.
Добавьте трансфекционную смесь по каплям на пластину и осторожно встряхните культуральную пластину в течение одной минуты, чтобы равномерно распределить трансфекционную смесь. Чтобы собрать клетки путем трипсинизации, замените культуральную среду одним миллилитром трипсина ЭДТА и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение трех минут. Затем нейтрализуют трипсин равным объемом сред, дополненных FBS.
Для каждой пластинки клеток переложите клеточную суспензию на две микроцентрифужные трубки с равными аликвотами и центрифугу в 300 раз G в течение пяти минут. После центрифугирования повторно суспендируют клеточную гранулу из одной трубки в один миллилитр PBS для секвенирования и в другую трубку, с ледяным холодом PBS для иммуноблота. Иммуноблот-анализ проводили для сравнения экспрессии CAS9 в нетрансфектированных и трансецированных клетках HFK.
Результаты показывают, что нетрансфицированные и трансецированные клетки HFK экспрессировали одинаковое количество CAS9, что указывает на то, что эффективность трансфекции одинакова между двумя клеточными линиями. Получены изображения иммунофлуоресцентной микроскопии фосфорилированного гистона H2AX S139 в трансфектированных клетках SgRNA/CAS9 и нетрансфектированном контроле. Результаты показали, что два двухцепочечных разрыва были вызваны CAS9 SgRNA.
Геномные вариации были сгруппированы по типам мутационных событий в HFK LXSN и HFK 8E6, где каждая группа геномных вариаций и общее количество вариаций сравнивались между HFK LXSN и HFK 8E6. Результаты показали, что 8E6 увеличивает геномные вариации в пределах 200 килобаз вокруг индуцированных CAS9 двухцепочечных разрывов, что указывает на то, что ВПЧ 8E6 дерегулирует восстановление двухцепочечного разрыва и увеличивает геномную нестабильность. Целью иммуноблота является измерение эффективности трансфекции, которую следует учитывать при анализе данных.
В дополнение к эффективности трансфекции, иммунофлуоресцентная микроскопия может быть использована для подтверждения индукции двухцепочечного разрыва с использованием фосфо-H2AX в качестве маркера. В качестве примера мы используем бета-версию HPV 8E6. Этот метод может быть использован для обнаружения изменений частоты или типа мутаций, вызванных другими реагентами, такими как ингибиторы малых молекул.
