Этот метод облегчает наблюдение в режиме реального времени синаптической активности кальция в качестве физиологического параметра для клеточных процессов, лежащих в основе обучения и формирования памяти в drosophila меланогастер. Сравнивая нейронные реакции на запахи до и после ассоциативной тренировки, мы можем нарисовать прямую корреляцию между синаптической активностью и образованием следа памяти у отдельных плодовых мушек. Для производства трансгенных плодовых мушек, в которых конкретные нейроны, представляющие интерес выразить генетически закодированный индикатор кальция крест женщины-девственницы и самцы мух проведения желаемого GAL4 и UAS конструкций, и возраст женского потомства до трех-шести дней после eclosion.
Чтобы подготовить муху для визуализации, используйте тонкие типсы, чтобы поместить ледяную анестезированной мухой в специально подготовленную камеру визуализации. Использование рассечения микроскопа для позиционирования грудной клетки и ног в контакте с электрическими проводами в нижней части камеры, и с головой, лежащей ровной. Исправить муху на месте с ясной клейкой лентой, и использовать хирургическое лезвие скальпеля, чтобы вырезать окно в ленте вокруг головы, в результате чего антенна покрыта и только передняя большая часть грудной клетки подвергаются.
Используйте булавку для насекомых, устоял вогнуто-выпуклые челюсти, чтобы тщательно окружить стороны и затылок с голубым светом лечения клея. И использовать синий свет, излучающий светодиодную лампу, чтобы установить клей. Когда клей полностью установлен, очистить любой остаточный неугощенный клей от спинной поверхности головы мухи и покрыть открытые кутикулы головы с каплей раствора Ringer's.
Используя очень тонкого лезвия ножом, прорезать кутикулу через заднюю часть головы, начиная с ocelli и резки каждой стороны медиальной для глаз, чтобы сформировать лоскут кутикулы, которые могут быть легко оторваны с помощью типсов. Удалите излишки кутикулы, которые могут блокировать область мозга интерес и использовать тонкие типсы, чтобы тщательно очистить спинную поверхность любой трахеи, заботясь, чтобы избежать нарушения самой ткани мозга. Удалите и освежите раствор Ringer по мере необходимости, чтобы очистить область от обломков тканей.
И поместите подкожный запах доставки иглы примерно в одном сантиметре от головы мухи, заботясь нет ничего, что могло бы помешать доставке запаха к антенне. Затем подключите камеру визуализации к системе доставки запаха через иглу доставки подкожного запаха. И дайте мухе 10 минут, чтобы оправиться от анестезии и операции.
Для визуализации индикаторов кальция на основе GFP настройте лазер мультикотонного микроскопа, оснащенного инфракрасным лазером и целью погружения в воду, установленной на изолированном столе вибрации, на восклицательный длина волны 920 нанометров и установите фильтр GFP bandpass. Используя ручку регулировки курса, сканируйте через ось мозга, чтобы найти область мозга, представляющих интерес. Используйте функцию урожая, чтобы сосредоточить сканирование только на области, представляющие интерес, чтобы свести к минимуму время сканирования.
И поверните представление сканирования так, что передняя часть головы обращена вниз. Затем отрегулируйте размер кадра до 512 на 512 пикселей и выберите область для сканирования. С учетом рассчитанного времени сканирования для каждого кадра, для достижения частоты кадров, по крайней мере четыре герц.
Для предварительной запрограммированной макропакета, способного связать программное обеспечение для получения изображений и программу доставки запаха, и начните измерение в программном обеспечении микроскопа в течение 6,25 секунд, чтобы установить базовое значение F0. В системе доставки запаха, доставить 2,5 секунды запах стимул, указанный здесь освещение светодиодов вызвано открытием и закрытием конкретных клапанов чашки запаха. Затем 12,5 секунд записи в конце запаха смещения.
Затем повторите доставку второго и третьего одоранта таким же образом. Для выполнения ассоциативного кондиционирования в этой установке, используйте компьютерную систему доставки запаха, чтобы представить условный стимул плюс запах в течение 60 секунд наряду с 12 90 вольт электрическим током. После 60 секунд перерыва настоящее состояние стимул-минус-запах только в течение 60 секунд без поражения электрическим током.
Измерьте запах тренировки столба evoked трансиент кальция снова путем повторять протокол стимуляции запаха pre тренировки 3 минуты после заканчивать этап тренировки. Затем сохраните файлы изображений в соответствующем формате для более длительного анализа изображений. Здесь представитель гриб тела выход нейрон изображения, приобретенные, как попродемонстрировано можно наблюдать.
Специфическое разобщенные выражения датчика dHomer-GCaMP3, которое не выражается в аксональных отсеках нейрона, демонстрирует перемежаемый сигнал в дендритном отсеке. Четкие, хотя и более низкие амплитуды запах ответы можно наблюдать у мух, выражаюющих dHomer-GCaMp3, по сравнению с мухами, выражают цитозол GCaMP6f. Здесь репрезентативные следы кальция от одной отдельной мухи демонстрируют различия в уровне шума и амплитуде, которые могут быть получены между отдельными препаратами.
Этот метод открыл возможность визуализации на субклеточном уровне, как обонятельные представления модулируются и как фазы памяти формируются через кондиционирование. Такие эксперименты будут иметь жизненно важное значение для расширения нашего понимания сложных структур мозга, таких как грибное тело, и для характеристики того, как ассоциативные воспоминания хранятся в распределенных популяциях нейронов.
