Наша лаборатория использует плодовую муху в качестве модельного организма для изучения того, как информация о вкусе обрабатывается через нейронные цепи, начиная с обнаружения химических веществ и заканчивая ее влиянием на поведение. Мы используем этот протокол визуализации для идентификации вкусовых клеток, которые реагируют на аминокислоты, и определения того, модулируют ли различные внутренние состояния реакцию вкусовых клеток на эти важные питательные вещества. Преимущество этого подхода к визуализации кальция заключается в том, что он позволяет регистрировать индуцированные вкусом нейронные реакции конкретных клеток у бодрствующих животных, где внутренние состояния остаются нетронутыми.
Теперь мы можем идентифицировать предполагаемые вкусовые цепи в новом коннектоме всего мозга дрозофилы и проверить функциональную динамику нейронов in vivo с помощью этого подхода к визуализации кальция. Для начала поместите муху под наркозом под микроскоп для вскрытия. С помощью ножниц для рассечения удалите среднюю и заднюю ноги в бедренном большеберцовом суставе и четыре ноги в вертеле.
Возьмите муху за крылья с помощью тупых щипцов, чтобы расположить ее головой выше целевого отверстия шейки матки камеры визуализации, в то время как тело находится внизу. Используя тупую сторону ножниц и тупые щипцы, аккуратно протолкните головку и грудную клетку одновременно в прорезь. Как только мушка надежно окажется внутри слота, отодвиньте ее назад и аккуратно переместите так, чтобы она была обращена к передней части патронника.
Соберите небольшую каплю лака для ногтей на конце зубочистки и нанесите тонкий слой, чтобы прикрепить голову мухи к камере визуализации. Возьмите восковой аппарат одной рукой и соберите небольшую капельку воска на кончике. С помощью полуострых щипцов в другой руке захватите один верхнечелюстной щупик и аккуратно вытяните и удерживайте хоботок в полном разгибании.
Прикоснитесь кончиком воскового аппарата к камере у основания хоботка, пока воск не начнет течь. Переместитесь, чтобы соприкоснуться с основанием хоботка и воском на полпути вниз по стержню, избегая контакта с сенсиллами этикетки. Затем полностью вытяните хоботок как можно прямее.
Теперь поместите установленных мушек в камеру с влажностью на 60 минут для восстановления. Удалите мух из камеры влажности. С помощью очень острых щипцов отщипните оба усика, зажмите кутикулу, чтобы создать отверстие, и вставьте одну сторону острых щипцов.
Проведите щипцами под кутикулой, чтобы удалить ее из области, охватывающей интересующую область мозга. Чтобы промыть открытый мозг, добавьте в голову примерно 100 микролитров искусственного раствора гемолимфы, или АГЛ. После промывания удалите АГЛ, оставив тонкий слой, чтобы предотвратить пересыхание мозга.
С помощью острых щипцов удалите воздушные мешки и любой крупный мусор, покрывающий мозг. Чтобы конкретно визуализировать подпищеводную зону, или СЭЗ, разрежьте пищевод у основания рядом с хоботком и в точке, где он проходит через мозг, используя очень острые щипцы. Снимите эту часть, чтобы обнажить СЭЗ.
Под микроскопом для препарирования поместите крышку размером 10 на 20 миллиметров в наклонное отверстие камеры визуализации. Загрузите примерно два микролитра воды или другого отрицательного контроля в капиллярную трубку. Найдите расчлененную муху и сфокусируйтесь на лабеллуме с помощью 10-кратного светлого объектива с эффектом погружения в воздух.
Выровняйте капилляр по лабеллуму под 10-кратным видом. Оставьте капиллярное положение непосредственно перед лабеллумом, убедившись, что он находится близко, но не соприкасается. Переместите рабочую область в центр интересующей вас области мозга.
Переключитесь на объектив для погружения в воду с большим увеличением, например объектив с 40-кратным увеличением. Добавьте примерно 200 микролитров AHL в верхнюю часть мозга, чтобы обеспечить контакт с целью погружения. Переключитесь на 488 нанометровую мощность лазера, чтобы определить экспрессию GCaMP в интересующей области.
Собрав не менее пяти секунд базовой флуоресценции, вручную переместите стимулятор так, чтобы капилляр покрывал лабеллум в течение пяти секунд. Уберите стимул и продолжайте съемку столько, сколько хотите. Затем снимите AHL и вернитесь к 10-кратному светлому полю, чтобы убедиться, что покровное стекло, стимулятор и лабеллум остаются в правильном положении.
Затем снимите камеру визуализации и с помощью безворсовой салфетки удалите первый раствор из капилляра. Промойте пипетку водой, и внесите примерно два микролитра очередного тастанта в капиллярную трубку. Относительное изменение флуоресценции у мух Gr64f GCaMP было значительно выше при стимуляции сахарозой по сравнению с водой, демонстрируя сильную и устойчивую реакцию нейронов сладких вкусовых рецепторов.
Относительная пиковая флуоресценция при стимуляции сахарозой была значительно выше, чем при водной. Изменение флуоресценции у мух Gr66a GCaMP было значительно выше при стимуляции кофеином, чем при водной стимуляции, демонстрируя реакцию на начало и выведение кофеина. Проекционный рисунок окончаний аксонов у мух Gr66a отличался от такового у Gr64f, демонстрируя анатомическую сегрегацию горьких и сахарочувствительных вкусовых рецепторных нейронов.
