Этот протокол облегчает идентификацию и изоляцию популяций живых коралловых клеток на уровне описания, который ранее был не возможен. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет получить доступ к уровню клеточной специфичности, который до сих пор был в основном недостижим. Демонстрация процедуры будет д-р Шеннон Сай, научный сотрудник из потока цитометрии совместного ресурса в Сильвестр Всеобъемлющего онкологического центра.
Чтобы настроить цитометр потока для сортировки живых коралловых клеток, откройте новый шаблон проекта в программном обеспечении цитометра потока и выберите соответствующие лазеры для анализа в лазерной панели. Затем создайте боковой рассеяние по сравнению с участком рассеяния вперед в соответствующих участках для настройки стратегии гэтинга и анализа. Для цитометрического анализа потока и сортировки живых коралловых клеток загрузите контрольный образец неописуемой клетки в выборку цитометра и начните процесс чтения.
Поскольку коралловые клетки особенно хрупкие, держите давление цитометра на низком уровне, чтобы предотвратить лиз клеток. В участке рассеяния отрегулируйте напряжение мультипликатора фотографии, чтобы центрить точки и начните записывать события. В вперед против бокового рассеяния участок, создать ворота вокруг клеток примерно на 10 до 4-й отметки на вперед рассеяния x-оси.
Замените контрольный образец на первый образец окрашенных клеток и завемите около 10 000 клеток перед паузой. Затем ворота события, которые являются уникальными для окрашенных образец группы. Для сортировки живых коралловых клеток, после выбора клеточной популяции, заинтересованной в программном обеспечении цитометра потока, поместите одну микроцентрифугную трубку, содержащую от 250 до 500 микролитров соответствующего раствора сбора, в камеру сбора цитометров для каждой популяции.
После того, как соответствующее количество времени прошло, чтобы избавиться от мусора, начать сортировку желаемой популяции для сбора в любом месте от 10000 до нескольких миллионов клеток. Каждый раз, когда используется новое пятно, вид или сортер, сортируют не менее 20 000 клеток, представляющих интерес, в 500 микролитров окрашивания среды, чтобы проверка чистоты проводилась на население, представляющие интерес, и повторно окрашивали отсортированные клетки, чтобы подтвердить, что события читаются в воротах, используемых для первоначальной сортировки. Для исследований in vitro храните отсортированную клетку на льду до тех пор, пока они не будут переданы в инкубатор или стерилизованную среду.
Чтобы принести в других неклеточных частиц, которые не имеют той же формы или детализации, как коралловые клетки могут быть удалены из анализа, создавая выбор ворот на вперед и стороны рассеяния участка. Мертвые клетки могут быть исключены путем сравнения сигнала DAPI необлиссных и окрашенных клеточных суспензий с помощью гистограммы и выгоняя высокие daPI-выражают клетки. Параллельно клетки, принимающие симбиоденезию аутофторесценции, могут быть удалены путем приготовки к клеткам с высоким сигналом в дальнем красном канале.
После этого итеративного процесса gating, остальные клетки представляют неповрежденные популяции живых коралловых клеток, не имеющих симбиоденазии. Эти клетки могут быть классифицированы в различные субпопуляции клеток путем окрашивания для таких функций, как реактивной активности видов кислорода и / или лизосомы содержания. Очень важно помнить, что некоторые клетки являются более хрупкими, чем другие, и запустить этот процесс как можно тщательнее.
После того, как конкретные клетки были изолированы, они могут быть использованы для x-vivo функциональных анализов, таких как создание клеточных культур и создание транскриптомных профилей.
