Ce protocole facilite l’identification et l’isolement des populations vivantes de cellules coralliennes à un niveau descriptionnel qui n’était pas possible auparavant. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’accès à un niveau de spécificité cellulaire jusqu’à présent pour la plupart inaccessible. La Dre Shannon Saigh, associée de recherche à la ressource partagée de cytométrie de débit au Sylvester Comprehensive Cancer Center, démontrera la procédure.
Pour configurer le cytomètre d’écoulement pour le tri vivant des cellules coralliennes, ouvrez un nouveau modèle de projet dans le logiciel de cytomètre à flux et sélectionnez les lasers appropriés pour l’analyse dans le panneau laser. Ensuite, créez une parcelle de dispersion latérale par rapport à une parcelle de dispersion vers l’avant dans les parcelles appropriées pour la mise en place de la stratégie de gating et d’analyse. Pour l’analyse cytométrique de flux et le tri des cellules coralliennes vivantes, chargez l’échantillon de cellules non tachées de contrôle dans la chambre d’échantillon du cytomètre et commencez le processus de lecture.
Comme les cellules coralliennes sont particulièrement fragiles, maintenez la pression du cytomètre basse pour prévenir la lyse cellulaire. Dans l’intrigue scatter, réglez la tension multiplicatrice photo pour centrer les points et commencer à enregistrer les événements. Dans la parcelle de dispersion avant contre côté, créez une porte autour des cellules autour de la 10 à la 4ème marque sur l’axe x de dispersion vers l’avant.
Remplacez l’échantillon de contrôle par le premier échantillon de cellules tachées et enregistrez environ 10 000 cellules avant de faire une pause. Ensuite, portez les événements qui sont uniques au groupe d’échantillons tachés. Pour trier les cellules coralliennes vivantes, après avoir sélectionné la population cellulaire d’intérêt pour le logiciel de cytomètre à flux, placez un tube de microcentrifugeuse contenant de 250 à 500 microlitres de la solution de collecte appropriée dans la chambre de collecte des cytomètres pour que chaque population trie.
Une fois qu’un temps approprié s’est écoulé pour éliminer les débris, commencez à trier la population désirée pour recueillir entre 10 000 et plusieurs millions de cellules. Chaque fois qu’une nouvelle tache, espèce ou trieur est utilisé, triez au moins 20 000 cellules d’intérêt en 500 microlitres de milieu de coloration pour permettre un contrôle de pureté sur la population d’intérêt et réanalysez les cellules triées pour confirmer que les événements sont lus à l’intérieur de la porte utilisée pour le tri initial. Pour les études in vitro, stockez les cellules triées sur la glace jusqu’à ce qu’elles soient transférées dans un incubateur ou un environnement stérilisé.
Pour apporter d’autres particules non cellulaires qui ne partagent pas la même forme ou granularité que les cellules coralliennes peuvent être retirés de l’analyse en créant une sélection de porte sur une parcelle de dispersion avant et latérale. Les cellules mortes peuvent être exclues en comparant le signal DAPI des suspensions cellulaires non tachées et tachées à l’aide d’un histogramme et en tachant les cellules à haut taux d’expression dapi. En parallèle, les cellules hébergeant la symbioseasia d’autofluorescence peuvent être enlevées en gating contre des cellules avec le signal élevé dans le canal rouge lointain.
Après ce processus itératif de gating, les cellules restantes représentent les populations vivantes intactes de cellules coralliennes manquant de symbioseasia. Ces cellules peuvent ensuite être classées en différentes sous-populations cellulaires en soudant des caractéristiques telles que l’activité réactive des espèces d’oxygène et/ou la teneur en lysosome. Il est essentiel de se rappeler que certaines cellules sont plus fragiles que d’autres et d’exécuter ce processus aussi soigneusement que possible.
Une fois que des cellules spécifiques ont été isolées, elles peuvent être utilisées pour des analyses fonctionnelles x-vivo telles que l’établissement de cultures cellulaires et la création de profils transcriptomiques.
