Bu protokol, canlı mercan hücre popülasyonlarının daha önce mümkün olmayan bir açıklama düzeyinde tanımlanmasını ve izole edilmesini kolaylaştırır. Bu tekniğin en büyük avantajı, şimdiye kadar çoğunlukla ulaşılmaz olan hücre özgüllüğü düzeyine erişim sağlar. Prosedürü gösteren Dr Shannon Saigh, sitometri sitometri paylaşılan kaynak Sylvester Kapsamlı Kanser Merkezi'nde bir araştırma görevlisi olacaktır.
Canlı mercan hücre sıralaması için akış sitometresini ayarlamak için, akış sitometre yazılımında yeni bir proje şablonu açın ve lazer panelindeki analiz için uygun lazerleri seçin. Daha sonra, gating ve analiz stratejisini ayarlamak için uygun arsalarda bir yan dağılım avere karşı ileri dağılım çizimi oluşturun. Akış sitometrik analizi ve canlı mercan hücrelerinin sıralanması için, kontrol lekesiz hücre örneğini sitometrenin örnek odasına yükleyin ve okuma işlemini başlatın.
Mercan hücreleri özellikle kırılgan olduğundan, hücre lisisini önlemek için sitometre basıncını düşük tutun. Dağılım çiziminde, noktaları ortalamak ve olayları kaydetmeye başlamak için fotoğraf çarpanı gerilimini ayarlayın. İleriye karşı yan dağılım çiziminde, hücrelerin etrafında, ileri dağılım x ekseninde 10 ila 4.
Kontrol örneğini lekeli hücrelerin ilk örneğiyle değiştirin ve duraklamadan önce yaklaşık 10.000 hücre kaydedin. Daha sonra lekeli örnek grubuna özgü olayları geçit. Canlı mercan hücrelerini sıralamak için, akış sitometre yazılımındaki ilgi hücre popülasyonundan birini seçtikten sonra, her popülasyonun sıralaması için sitometre toplama odasına uygun toplama çözeltisinin 250 ila 500 mikrolitresini içeren bir mikrosantrifüj tüpü yerleştirin.
Bir kez zaman uygun bir miktar enkaz dışarı floş geçti, her yerde toplamak için istenilen nüfus sıralama başlar 10, 000 için birkaç milyon hücre. Her yeni leke, tür veya ayıklayıcı kullanıldığında, en az 20.000 ilgi hücresini 500 mikrolitre boyama ortamına sıralayarak ilgi popülasyonu üzerinde saflık kontrolü yapılmasını sağlar ve sıralamalı hücreleri yeniden analiz ederek olayların ilk sıralama için kullanılan kapıda okunduğunu onaylayın. In vitro çalışmalar için, bir kuvöz veya sterilbir ortama transfer edilene kadar buz üzerinde sıralanmış hücreleri saklayın.
Mercan hücreleri ile aynı şekil veya tanecikliliği paylaşmayan diğer hücresel olmayan parçacıkları getirmek için, ileri ve yan dağılım çiziminde bir geçit seçimi oluşturarak analizden çıkarılabilir. Ölü hücreler, lekesiz ve lekeli hücre süspansiyonlarının DAPI sinyalini histogram kullanarak karşılaştırarak ve yüksek DAPI ifade eden hücreleri gating ile dışlanabilir. Buna paralel olarak, otofloresan simbiyodenaziyi barındıran hücreler uzak kırmızı kanalda yüksek sinyal ile hücrelere karşı gating tarafından kaldırılabilir.
Bu yinelemeli gating işleminden sonra, kalan hücreler simbiyodenazisi eksik bozulmamış canlı mercan hücre popülasyonları temsil eder. Bu hücreler daha sonra reaktif oksijen türleri aktivitesi ve/veya lizozom içeriği gibi özelliklerle boyanarak farklı hücre alt popülasyonlarına sınıflandırılabilirler. Bazı hücrelerin diğerlerinden daha kırılgan olduğunu hatırlamak ve bu işlemi mümkün olduğunca dikkatli bir şekilde yürütmek çok önemlidir.
Belirli hücreler izole edildikten sonra, hücre kültürleri oluşturma ve transkripsiyonomik profiller oluşturma gibi x-vivo fonksiyonel denemeler için kullanılabilir.
