Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о значении динамики экспрессии генов в пролиферации и дифференциации клеток, в частности, о динамике сигнальных молекул Notch в нервных стволовых клетках. Основным преимуществом этого метода является то, что мы можем контролировать экспрессию генов как in vitro, так и in vivo с очень высокой точностью с помощью живой визуализации. Демонстрация процедуры будет Хироми Shimojo, доцент из моей лаборатории, который разработал эту новую технологию.
Для Dll1 F luciferase репортер введение в NPC, подтвердить отсутствие ответа на педаль рефлекс в эмбриональный день 12,5 до 14,5 беременных мыши, прежде чем сделать два-три сантиметра разрез через живот, вдоль средней линии. Поместите пропитанную PBS марлю вокруг разреза и используйте кольцеобразные типсы, чтобы тщательно извлечь правый рог матки. После подсчета эмбрионов, использовать микро капилляр для введения от одного до двух микролитров смешанных Dll1 F люцифераза репортер ДНК в желудочек теленцефалона каждого эмбриона.
Успешная инъекция приведет к соблюдению синего красителя над поверхностью матки. Для электропорации, мокрые матки и электрода с PBS, и осторожно схватить голову первого эмбриона. Установите положительно заряженный электрод в сторону полушария, в которую вводили ДНК, и обеспечьте пять 30-50-вольтовых 50-миллисекундных импульсов с одной секундной паузой между импульсами, проверяя, что пузырьки генерируются из отрицательно заряженного электрода.
Когда все эмбрионы были введены, вернуть левый рог матки в живот, и использовать 17-миллиметровую иглу, чтобы закрыть разрез с 4-0 шелковый шов, размещение теплой PBS в брюшной полости до завершения закрытия. Чтобы создать диссоциированную культуру NPC, в первую очередь матка из эмбрионального дня 12,5 до 14,5 беременных Dll1 убиквитинированных люциферазы трансгенной мыши в 10-сантиметровую чашку Петри, содержащую 25 миллилитров ледяной PBS, и использовать микро ножницы и тонкие миппы для удаления эмбрионов из матки. Обезглавив эмбрионы, поместите головы в новую 10-сантиметровую чашку Петри, содержащую ледяной DMEM/F12, и удалите эпидермис и хрящ, окружающий каждый мозг.
Перенесите мозг в 35-миллиметровую тарелку под рассеченным микроскопом, содержащим три миллилитров ледяной среды N2B27. Удалите правый и левый теленцефалон из диэнцефалона. Используйте тонкие типсы, чтобы удалить опоясывания, покрывающие поверхность теленцефалона, и вскрыть дорсолатерарную часть коры из теленцефалона.
Когда все представляющие интерес нервные ткани были изолированы, используйте P1000 пипетку для передачи образцов в отдельные 1,5-миллилитровые трубки, и использовать P200 пипетку, чтобы аспирировать любые дополнительные среды из каждой трубки. Добавьте 100 микролитров раствора папаина в паре коры головного мозга и поместите образцы на 24 градуса по Цельсию в течение 15 минут. В конце инкубации, осторожно pipette образцы 10 раз с новой P1000 пипетки, и вернуть трубы до 24 градусов по Цельсию в течение еще 15 минут.
В конце инкубации, осторожно pipette образцы снова перед сбором переваренных тканей центрифугации. Аспирировать супернатанты, и осторожно повторно каждой гранулы с одним миллилитрОМ DMEM / F12 среды. Центрифуга образцов еще три раза, как только что продемонстрировали, мягко resuspending каждой гранулы со свежим миллилитр среды после каждой центрифугации.
После последней центрифугации, повторно гранулы в 500 микролитров N2B27 среды дополняется одним миллимолярный люциферин, и семена один раз от 10 до шести клеток из каждого образца на отдельные поли-L-лизин покрытием стеклянные нижней посуды. Затем поместите пластины в инкубатор клеточной культуры на один час. После того, как клетки придерживались блюдо, добавить два миллилитров свежей N2B27 среды плюс один миллимолярный люциферин к каждой пластине.
Чтобы визуализировать выражение репортера люциферазы в культурах диссоциации NPC, выберите цель погружения масла и поместите образец блюда на сцену микроскопа. Просмотр поля вручную, чтобы определить наилучшее положение для просмотра ячеек, и сосредоточиться на ячейках, представляющих интерес. Нажмите Live, чтобы получить изображение теста, и используйте программу Multi-Dimensional Acquisition для времени приобретения путем двумерного люминесценции и ярко-полевых приобретений в течение 24 часов.
Чтобы подготовить развивающихся культур ломтик коры, на следующий день после инъекции репортера, урожай эмбрионального дня 13,5 до 14,5 эмбриона мозга, как попродемонстрировано, и место блюдо, содержащее мозг на стадии флуоресценции стереоскопический микроскоп. Подтвердите, что каждая кора выражает вводили флуоресцентный репортер под соответствующим светом возбуждения, и передать мозг силиконовой резиновой разделонной доске заполнены 30 миллилитров DMEM/F12 среды, пузырились со 100%кислородным газом. Используйте микрохирургический нож и тонкие типсы, чтобы сократить границу между медиальной и боковой частью спинного теленцефалона, и разделить ткань на два полушария.
Затем используйте нож, чтобы разрезать кору, как полосы, чтобы получить корковые ломтики, передавая ломтики в среде от разделочной доски в новую 35-миллиметровую чашку Петри, как они приобретены. Когда все ломтики были собраны, поместите разрезанную поверхность каждого ломтика на культурную вставку, установленную в стеклянную нижнюю тарелку, содержащую обогащенную среду, регулируя ориентацию каждого ломтика мелкими типсами по мере необходимости. Затем удалите излишки среды с помощью пипетки и поместите блюдо в мульти-газовый инкубатор, установленный на 40% кислорода, 5%углекислого газа и 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
В конце инкубации добавьте в культурное блюдо 300 микролитров обогащенной среды, дополненных 1 миллимолярной люциферином. Чтобы визуализировать выражение репортера люциферазы в срезе культур, выберите 40x цель, и поместите образец блюдо на стадии микроскопа. Приобретите тестовое изображение флуоресценции, а также установите положение и сфокусировать плоскость в область интереса под освещением соответствующего возбудительного света.
Затем запустите замедленное приобретение трехмерной люминесценцией, флуоресценцией и приобретениями яркого поля в течение 24 часов. Для мониторинга промоутерской активности колеблющегося гена Dll1 можно использовать убиквитинированную люциферазу, дестабилизированным люциферазным репортером с полурастястью около 10 минут. Как флуоресцентный репортер, репортер люциферазы может быть использован для мониторинга динамики экспрессии белка, будучи слиты с геном кодирования последовательность интереса.
Чтобы визуализировать экспрессию репортера на одноклеточном уровне в культурах тканей, ген репортера может быть временно трансфицирован в NPC через в утробе матери электропорации, как попродемонстрировано. Кроме того, визуализация на основе микроскопа позволяет получить изображения яркого поля, флуоресценции и химилюминесценции. Репортер Dll1 промоутер деятельности экспонатов осцилляции выражение в NPCs, полученных из теленцефалона Dll1 ubiquitinated F luciferase репортер мышей, с дестабилизированным люцифераза репортер указывает резкое вверх и вниз регулирования выражения промоутерской деятельности.
В смежных расширенных зеленых флуоресцентных белково-положительных клеток, несущих Репортер Hes1 и mCherry-положительные клетки, выражаюющие Dll1 белка репортер, который в контакте друг с другом во время наблюдения, Hes1 репортер выражение, как представляется, начать около 60 минут после контакта, предполагая, что задержка времени для передачи Notch сигнализации между соседними клетками составляет около одного часа. Кроме того, при передаче сигнала экспрессия белка Dll1 демонстрирует динамическую транслокацию. При приобретении биолюминесценции изображения, держать микроскоп комнате полностью темно, как посторонний свет может предотвратить оптимальное приобретение.
Последние разработки в области оптогенетики позволяют нам контролировать экспрессию генов светом. С помощью этого метода, мы можем одновременно ввести различные модели экспрессии генов и контролировать люцифераза репортер ответов.
