Этот протокол содержит стандартизированную методологию подготовки и обработки мышечной ткани в доклинических условиях и клинических испытаниях, что важно для получения надежных результатов в области DMD. Методы актуальны для exon пропуска tryouts для DMD. И главное преимущество в том, что они хорошо зарекомендовали себя и воспроизводимы, если осуществляться коллективно.
Эти методы в основном сосредоточены на exon пропуска в DMD, но с изменением грунтовки, те же методы могут быть применены к другим заболеваниям, обработанным сращивания терапии. Эти методы могут быть использованы для достижения экзон пропуская эффективность как РНК и белка. Чтобы подготовить образец для анализа, сначала смешайте равные объемы трагакантовой резинки и воды, пока жвачка не станет мягкой и липкой.
Загрузите эту смесь в 25 миллилитровых шприцев и вылейте от 0,5 до одного сантиметра жвачки на отдельные пробковые диски. Этикетка дисков на противоположной стороне и поместите контейнер изопентан в жидкий азот, пока некоторые из жидкости замерзает. Поместите каждый образец в трагакантовую резинку на дисках с продольной оси каждой мышцы перпендикулярно пробке.
Поместите резинку вокруг в нижней части каждой мышцы, чтобы помочь держать мышцы на месте, и использовать пинцет, чтобы заморозить образцы в холодной изопентан. Перемещение образцов непрерывно в течение одной минуты или до полного замораживания, прежде чем поместить их временно на сухой лед. Затем поместите образцы в стеклянные флаконы для хранения 80 градусов по Цельсию.
Для раздела замороженных мышечной ткани для анализа, установить криостат к рабочей температуре 25 градусов по Цельсию, и смонтировать мышечный блок на держатель. Обрежьте блок ткани до тех пор, пока не будут достигнуты плоские секции. Для обратной транскриптазы ПЦР и западного анализа помарки, получить 10 микрометров толщиной ломтиками.
Для иммуногистохимического анализа, получить от шести до восьми микрометров толщиной ломтиками, а для гематоксилина и эозина окрашивания, получить от 10 до 12 микрометров толщиной ломтиками. После их приобретения поместите нарезанные секции в две миллилитровые трубки. Храните образцы для ПЦР и западной blotting при 80 градусов по Цельсию.
Здесь показаны система электрофореза микрочипа, гель-изображения реакций обратной транскриптазы ПЦР и результаты секвенирования пропущенной полосы от двух пациентов до и после лечения антисенс-олигонуклеотидом в фазе эскалации дозы первого исследования. Оба пациента гавани удаления. Как и ожидалось, перед лечением, оба пациента показали, не пропуская и только не пропустил полоса может быть визуализирована.
После 12 недель лечения, четкая пропущенная нижняя полоса была визуализирована для второго пациента, однако, было все еще трудно обнаружить любой пропущенный продукт для первого пациента. Результаты секвенирования показали конкатенацию экзонов 47 и 54 для второго пациента, и экзонов, 44 и 54 для первого пациента. Для расчета пропущенного процента концентрация моляров для пропущенной полосы была разделена пропущенными и неотрековатыми полосами.
Как и ожидалось, до начала лечения западной помарки не было обнаружено ни одной дистрофии. После лечения, полоса была обнаружена у второго пациента с более низким молекулярным весом по сравнению с тем, что наблюдается в здоровом контроле. Первый пациент, однако, не показал никаких обнаруживаемых уровней дистрофина после лечения.
Очень важно правильно обрабатывать мышечную ткань и последовательно поставить каждый образец на трагакантовую резинку. Разделы тканей могут быть проанализированы различными способами, в том числе искусственные ПЦР, цифровой ПЦР, Западная помарка, иммуногистохимия, и с различными типами омиков. Эти методы могут быть ускорены, развитие, дополнительные exon пропуск наркотиков ориентации различных экзонов, и могут быть применены к разработке вирусных основе и снова в редактировании для DMD.
