ИММУНОпреципитация РНК в тандеме с последующим секвенированием, или RIPiT-Seq, является методом определения того, какие регионы РНК связаны определенной парой связывающих РНК белков. Самым уникальным преимуществом RIPiT является его способность ориентироваться на два различных белка в двух очистителях. Это обеспечивает мощный способ обогащения для композиционно различных РНК белковый комплекс из других комплексов.
Кроме того, RIPiT-Seq является УФ-перекрестной независимой, и может быть применен ко многим белкам, которые действуют на РНК без непосредственного связывания его. Хотя этот метод непосредственно не распространяется на терапию или диагностику, РНК связывания белков и РНК обработки были связаны с несколькими заболеваниями, как невропатии и рак. RIPiT-Seq предоставляет инструмент для изучения функций связанных с болезнью РНК связывающих белков.
RIPiT-Seq требует системы, в которой может быть выражен белок с тегами эпитопа. Он был протестирован только в клетках HEK293, и является наиболее подложным к клеточной культуре. Однако теперь, когда мы можем отмечать белки с помощью CRISPR, RIPiT-Seq может быть применим к различным современным системам.
Успех RIPiT зависит от двух эффективных иммунопреципитий, поэтому крайне важно оптимизировать условия иммунопреципитации для использования антител. Кроме того, работа с РНК требует надлежащих мер предосторожности, поэтому реагенты без RNase следует использовать во время и после экстракции РНК. Демонстрацией процедуры будет Лорен Вудворд, аспирант в моей лаборатории.
Начните с мытья монослойных клеток мягко с 15 миллилитров охлажденной PBS на 15 сантиметров пластины. Затем соскребать клетки в 30 миллилитров PBS и собирать их в 50 миллилитров конической трубки. Пеллет клетки центрифугирования на 400 г в течение 10 минут при 4 градусах по Цельсию, и отказаться от супернатанта.
Добавьте четыре миллилитров ледяного гипотонического буфера лиза и используйте пипетку P1000 для повторной приостановки клеток. Перенесите лисат в пятими миллилитровую трубку и инкубировать на льду в течение 10 минут. Поместите лисат в ледяную ванну и sonicate в соответствии с рукописными указаниями.
Затем добавьте 108 микролитров пяти хлорида молярного натрия, чтобы скорректировать концентрацию соли до 150 миллимоляров. Затем центрифуга лизат на 12 000 г в течение 10 минут при четырех градусах по Цельсию, и собрать 20 микролитров супернатанта для западного анализа помарки. Предварительно промыть бусинки FLAG agarose в соответствии с рукописными указаниями и применить оставшиеся supernatant до 750 микролитров бисера в пяти миллилитров трубки.
Инкубировать бусинки FLAG агарозы с экстрактом клетки в течение одного-трех часов при четырех градусах по Цельсию с нежным смешивания. После инкубации гранулировать бисер центрифугой при 400 г в течение одной минуты при четырех градусах по Цельсию и собрать 20 микролитров супернатанта для анализа западной помарки. Отбросьте оставшийся супернатант и вымойте бусины, перерасходуя их в четыре миллилитров буфера для мытья изо.
Пеллет бисер снова и удалить супернатант. Разбавить RNase I в 750 микролитров изо мыть буфер в соответствии с рукописными направлениями, и добавить его в бусинки FLAG агарозы. Инкубировать смесь при четырех градусах по Цельсию с нежным смешиванием, а затем гранулировать бисер центрифугации.
Соберите 20 микролитров супернатанта для анализа западной помарки, а остальное отбросьте. Затем, мыть бисер с iso мыть буфер, как описано ранее. Затем выполните сродство elution, добавив 375 микролитров элюционного буфера в бисер, и встряхивая смесь мягко при четырех градусах по Цельсию в течение одного-двух часов.
После инкубации, гранулы бисера и собирать 15 микролитер aliquot элюции для западного анализа пятно. В то время как сродство elution ведется, выполнять магнитные спряжения антител шарика. Начните с мытья 50 микролитров магнитных бусин в одном миллилитре буфера мытья изо.
Повторное использование бисера в 100 микролитров спряжения буфера и добавить соответствующее количество антител. Затем инкубировать бисер, по крайней мере 10 минут при комнатной температуре. Вымойте магнитные бусы дважды с помощью буфера спряжения и повторно поместите бисер в 375 микролитров буфера разбавления RIPiT.
Храните бисер на льду до иммунопреципиентации. Нанесите сродство FLAG elution на магнитные бусы, связанные с антителами, и инкубировать с нежным смешиванием в течение одного-двух часов при четырех градусах Цельсия. Захват магнитных бусин с магнитом и собирать 15 микролитров супернатанта для анализа западной пятно.
Затем, мыть бисер семь раз с iso мыть буфер. Продолжить денатурации elution путем повторного перерасхода магнитных бусин в 100 микролитров четкого буфера образца и инкубации подвески на льду в течение 10 минут. Во время инкубации периодически щелкайте бисером, чтобы повторно их раздать.
Захват магнитных бусин на магните и собрать 15 микролитров elution для западного анализа пятно. Перенесите оставшуюся элюцию в новую 1,5 миллилитровую трубку. Чтобы извлечь РНК, добавьте 320 микролитров воды без RNase и 400 микролитров фенол-хлороформного изоамилового спирта в RIPiT elution.
Вихрь смеси, а затем центрифуга его на 12000 г в течение пяти минут. Соберите 350 микролитров аквеозной фазы в отдельную трубку. Добавьте ацетат натрия, хлорид магния, гликоген и этанол в собранный образец и инкубировать смесь на ночь при отрицательном 20 градусов по Цельсию.
На следующий день гранулы РНК центрифугации на 12 000 г в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия и мыть его в 70% этанола. После мытья этанолом обработать РНК полинуклеотидной киназой Т4, или PNK, без АТФ, и выполнить фенол-хлороформную очистку в соответствии с рукописными указаниями. Перепробовать чистую РНК в 4,5 микролитерах воды без RNase.
Для количественной оценки урожайности РНК, радиолабель РНК с PNK и 32P помечены ATPs в соответствии с рукописными указаниями. Используйте низкий диапазон ДНК лестницы и от 20 до 40 нуклеотид синтетических олиго для размера и количества стандартов. Разрешить помечены РНК на 26%мочевины-полиакриламид гель.
Высушите гель в соответствии с рукописными указаниями и подвергайте гель фосфоэкрану до тех пор, пока не будет обнаружен адекватный сигнал. Этот метод был использован для исследования взаимодействий экзон соединения комплекса или ЕЕК. Западный анализ белков, очищенных от каждого важного шага в процедуре RIPiT, показывает, что очищенный EJC содержит как EIF4A3, так и MAGOH.
Отрицательный контроль, HNRNPA1, не обнаруживается в elution. Сила сигнала РНК-следа коррелирует с количеством взаимодействия РНК-белка. Более сильный след наблюдается, когда RIPiT был выполнен на клетках, обработанных пуромицином, что увеличивает заполняемость EJC на РНК.
Для того, чтобы RIPiT был эффективным, важно проверить эффективность ИС по западной помарке. Также важно оценить количество и качество РНК до начала глубокого последовательности. В 2018 году лаборатория Сингха успешно использовала этот метод для очистки двух композиционных различных вариаций экзон-соединения комплекса и определения связующего шаблона РНК.
Если исследователи решили обнаружить СЛЕДы РНК с помощью ауторадиографии, следует соблюдать все надлежащие процедуры и протоколы радиационной безопасности.
