Оценка контрактивных свойств миофибрил, изолированных от полосатых мышц, может быть использована для определения того, является ли саркомерная дисфункция основной причиной мышечной слабости из-за мутаций в саркомерных белках. Этот метод может быть использован для получения данных с очень высоким соотношением сигнала к шуму с разрешением нанонютон. Этот протокол также подходит для измерения контрактности в промеабилизированных кардиомиоцитов.
Имейте в виду, что сила превлододер очень хрупкая. Поэтому при удалении клея из монтажной иглы или при склеивания миофибриля, вы должны иметь твердую руку, много практики, и много терпения. Перед монтажом ткани поместите стержень гомогенизатора в трубку, содержащую мышечную ткань.
Сохраняя трубку на льду, вращаем ротор в течение 15 секунд на скорости пять. В конце гомогенизации перенесите 50 микролитров полученной подвески миофибриля и 250 микролитров расслабляющего раствора на поли-HEMA покрытием слайда в тканевой ванне. Накройте ванну крышкой, чтобы защитить смесь от пыли и ждать от 5 до 10 минут, чтобы миофибриль упасть на дно капли.
Во время погружения миофибрилов, тепло Shellac этанола клей при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 30 до 60 секунд, прежде чем добавить около шести микролитров клея на неокрашенные стеклянные слайды. Неоднократно окуните кончик каждой монтажной иглы в клей до тех пор, пока не будет виден слой клея. Затем используйте микро-манипуляторы для перемещения зонда и пьезо вертикально, чтобы освободить место для ванны ткани на стадии микроскопа и удалить стеклянную горку, содержащую клей.
После монтажа миофибриль, чтобы измерить длину саркомера, перемести пьезо и/или силовой зонд, чтобы установить начальную длину саркомера миофибриля до 2,5 микрометров. Используя функцию сосуда программного обеспечения системного контроллера, измерьте длину и ширину миофибриля. Используйте стадию микроскопа, чтобы распоить миофибриль в центре видео изображения и растянуть прямоугольник с одной стороны миофибриля на другую, заботясь о том, чтобы включить темный край клеевых капель.
Чтобы начать запись данных, нажмите кнопку "Начать". Через пять секунд нажмите паузу. Длина будет записана.
Чтобы измерить ширину, поверните камеру на 90 градусов, чтобы посмотреть контраст края самого миофибриля. Отрегулируйте прямоугольник и нажмите кнопку, чтобы начать запись данных. Через пять секунд нажмите паузу.
Ширина будет записана. Чтобы распоить стекло theta, используйте окуляр и манипулятор, чтобы тщательно переместить стекло theta к миофибрилу. Выровняйте верхний канал theta стекла с миофибрилем и выполнить быстрый шаг, чтобы проверить положение.
Включите фоновый расслабляющий поток, чтобы проверить выравнивание теты стекла и использовать рычаг клапана Luer, чтобы включить приток камеры потока. Затем, чтобы начать осушеть камеру потока и предотвратить переполнение камеры потока, установите клапан насоса оттока для клапана ванны два, микро-ступенчатый режим до микро, поршень цели до 48000, и скорость поршеня до 38 до 40. Чтобы измерить скорость редевелопмента напряжения, рассчитайте движение пьезо, необходимое для ослабления миофибриля на 15% и введите это значение в сигнальный генератор.
Нажмите резюме, чтобы продолжить запись данных и открыть клапаны один и шесть, чтобы начать потоки расслабляющий раствор и различные концентрации кальция через стекло теты соответственно. Выберите диапазон сброса на интерферометре, чтобы сбросить диапазон интерферометра так, чтобы базовая сила была равна нулю вольт. Когда след силы стабилен, выполните theta стекло быстро шаг с размером шага 100 микрометров.
Когда сила плато будет достигнута, выполнить сокращение повторно растянуть с пьезо. Будет записан след релаксации активации. Нажмите паузу.
Для выполнения шаг-мудрый стрейч, нажмите кнопку запуска и сбросить диапазон интерферометра так, что базовая сила равна нулю вольт. Выполните шаг-мудрый стрейч с генератором сигнала. Когда участок закончен, используйте пьезо, чтобы сократить миофибриль до вялой длины.
Затем нажмите паузу и остановитесь и сохраните данные. Здесь показаны следы силы активного силового эксперимента с миофибрилью, изолированной от здоровых человеческих четырехглавых мышц. Миофибриль активировался пять раз с растворами с различной концентрацией кальция, со средней максимальной силой всех миофибриллей около 123 миллиневтонов на квадратный миллиметр.
Конструкция кривой концентрации силы кальция из сил плато, достигнутых во время каждой активации в каждой из пяти кривых кальция, позволяет вычислить концентрацию кальция на уровне 50% от максимальной силы производства. Как показано в этом репрезентативном анализе, миофибрили можно лечить несколькими соединениями в одном эксперименте, чтобы ответить на дополнительные вопросы о типе миофибриля. Активная сила и длина саркомера также могут быть измерены, чтобы позволить расчет темпов реконструкции, активации и релаксации.
Крутой подъем, показанный в пунктирной красной коробке, вызван как вязкостью, так и эластичностью. Плато напоминает только эластичный компонент. Поскольку вязкость сопротивляется деформации линейно, сила упала после того, как напряжение было удалено.
При позиционировании theta стекла, убедитесь, что вы выровнять его должным образом с myofibril. В противном случае, решение активации может прийти между оптическим волокном и кантилевером силового зонда, и это приводит к тому, что артефакты происходят в ваших данных. Кроме того, миофибриль не может активировать должным образом.
Этот метод перфузии также подходит для определения типа мышечного волокна миофибриля. Например, вы можете сначала пронизать миофибриль с нормальным раствором кальция с последующим перфузией того же раствора, но затем добавить специфическое форс-повышательное соединение типа мышечного волокна.
