Метод позволяет четко отличать интегрированные структуры амилоидного белка от растворимых и даже накопленных аналогов. Техника выполняется in vivo в неинвазивной манере практически без токсичных побочных эффектов. Поскольку он зависит от флуоресцентных свойств самого флюорофора, он очень прочный и воспроизводимый с течением времени.
FLIM был использован в области диагностики рака. Тем не менее, мы используем его для изучения основных механизмов агрегации белка, которые действительно имеют отношение к нейродегенеративным заболеваниям. Методология может быть использована в области агрегации белка.
До тех пор, как болезнь связанных белка помечены флуоресцентный зонд, он может отслеживаться и контролироваться с течением времени. Соединения и стратегии, которые либо способствуют, либо препятствуют агрегированию, могут быть успешно изучены. Любая биологическая система, позволяющая визуализировать с помощью световой микроскопии, подходит для FLIM либо in vivo, либо ex vivo, например, в клеточной культуре, в зацикленных или проницаемых образцах и в любой необходимой среде.
Убедитесь в том, чтобы проверить свойства выбранного фторфора в нематоде до получения экспериментальных данных и проверить, что установка полностью функциональна перед приобретением измерений. Для начала выращиваем и поддерживайте нематод при 20 градусах Цельсия на ngM пластинах. Возраст нематод до дня четыре жизни, как молодые взрослые и восьмой день жизни, как старые взрослые.
В день визуализации начните с подготовки слайдов изображений. Место агарозы и двойной дистиллированной воды в концентрации 3%weight по объему. Перенесите его в микроволновую печь, чтобы расплавить, а затем дайте ему немного остыть.
Вырезать кончик одного миллилитров пипетки отзыв и принять примерно 200 микролитров расплавленной агарозы. Pipette агарозы на чистую стеклянную горку и сразу же место второй на вершине избежать образования каких-либо пузырьков. Оставьте слайды высохнуть и аккуратно удалите верхнюю стеклянную горку.
В результате получится стеклянная горка с равномерной поверхностью агарозы, на которой будут расположены нематоды. После того, как установка изображений готова к использованию, работая под стерео микроскопом, поместите 10 микролитровую каплю обезболивающего соединения на агарозную площадку и аккуратно перенесите в нее от пяти до 10 нематод. Используйте наконечник ресниц, чтобы отделить нематод.
Держите их близко друг к другу, но не касаясь, чтобы облегчить локализацию нематод во время получения изображения. Тщательно наложить нематод с крышкой. В течение одного часа после монтажа, принять измерения.
Убедитесь, что нематоды полностью неподвижны. Откройте программное обеспечение для приобретения FLIM. Найдите кнопку вкладок и нажмите, чтобы обеспечить выходы.
Поместите слайд с установленным c.elegans на сцене и с помощью 10X увеличение объектива в режиме передачи, локализовать положение нематод на слайде. Снимите слайд, переключитесь на объектив увеличения 63X и нанесите требуемую среду погружения. Поместите горку на сцену и локализуйте нематод.
Начните сканирование образца. Выберите область интереса и сосредоточьтесь на максимальной проекционной плоскости. На интерфейсе программного обеспечения FLIM можно просмотреть количество обнаруженных фотонов.
Значение ADC должно быть от одного раза 10 до четвертого и один раз от 10 до пятого. При необходимости смещайте фокус на другую плоскость или увеличьте мощность лазера, чтобы собрать больше фотонов. Убедитесь, что вы избегаете накопления фотонов, но собираете достаточное количество фотонов, чтобы создать хорошую жизнь подходят и измерения.
В баре меню выберите вкладку для набора параметров приобретения. Выберите синхронизацию сканирования, чтобы обеспечить обнаружение одного фотона. Установите приобретение на фиксированное количество времени или фиксированное количество фотонов.
Пресса начинает приобретение. Откройте программное обеспечение и импорт файлы данных FLIM через файл, загрузите данные FLIM. Загрузите все образцы из одного состояния, даже если они получены в разных сеансах и из разных биологических повторов.
При необходимости сегмент для сигнализации нематод для многих FLIM изображение через сегментации, сегментации менеджера. Перетащите инструмент обрезки вокруг области, представляющие интерес, пока он не будет выделен. После завершения, нажмите OK. Выберите небольшой регион, где отображается изображение C.elegans на основе интенсивности.
Кривая распада этой области отображается в большом окне распада на правой стороне интерфейса. Чтобы экстраполировать срок службы на вкладке данных, установите произвольно интегрированное минимальное значение от 40 до 300, чтобы исключить любые пиксели, которые слишком тусклые, чтобы хорошо подходят. Выберите минимальный срок и максимальное число времени, чтобы ограничить сигнал FLIM этими значениями.
Не меняйте заданные подсчеты фотона одного из них. Вввейте скорость повторения в мегагерц лазера, используемого во время приобретения. Вввещаете максимальное значение ворот, чтобы исключить все насыщенные пиксели.
На вкладке продолжительности жизни выберите глобальную установку, которая будет использоваться. Не меняй никаких других параметров, кроме количества экспоненциального отбора, если известно, что выбранный распад флуоресценции является многорасциациаливным и демонстрирует более одного срока службы. Загрузите IRF через меню IRF.
Для оценки смены IRF выберите IRF, оцените сдвиг IRF. Набор значений автоматически отображается на вкладке IRF. Как только это будет установлено, не меняй других параметров этой вкладки.
После того, как все параметры установлены, нажмите подходят набор данных. Полученная подгонка, выделенная синей линией, должна перекрываться со всеми событиями. Хорошая подгонка получается, когда все события выровнены вдоль подгонки.
Нажмите на вкладку параметров, расположенную в правом верхнем меню интерфейса программного обеспечения, и выберите статистику, средневзвешенное значение и убедитесь, что значение квадрата чи как можно ближе к одному. Таким образом, значение продолжительности жизни выбранного изображения раскрывается как тау-один. Экспорт любой информации, представляющих интерес через файл, изображения интенсивности экспорта, подходят таблицы результатов, изображения, гистограммы.
Здесь показаны репрезентативные карты C.elegans, выражают мускулистую RFP No40 на четвертый или восьмой день жизни. Чем длиннее, тем больше уровень I'85 был более склонен к агрегации, и уже на четвертый день жизни в гистограмме был флуоресцентный сдвиг. В самом деле, на четвертый день, очаги формирования наблюдалось для I'85 в то же время отсутствует в I'44.
После старения, однако, I'44 также выставлены очаги формирования и, таким образом, снижение срока службы флуоресценции. Наконец, образование очагов не было обнаружено и не было уменьшено срок службы флуоресценции в штамме N'40CFP. Для этого штамма, были только тонкие незначительные незначительные изменения в среднем флуоресценции жизни при старении.
После того, как модель нематод установлена, количество собранных фотона имеет первостепенное значение для получения хорошей жизни подходят. Метод можно далее соединять с различными методами, такими как передача резонансной энергии Форстера, FRET, восстановление флуоресценции после фотоблейлинга, FRAP или измерения. Все эти приспособления дают дополнительную информацию о свойствах белковых исследований и их агрегированной форме.
В области агрегации белка и белка гомеостаза, техника позволила исследовать любые возмущения, наложенные на систему, распределение различных видов белка, и торговли и в целом разница и значение растворимых и нерастворимых белковых фракций в живом организме. Обезболивающее азид натрия является токсичным и должны быть обработаны перчатками и очками и разбавленной под капотом дыма. Поскольку метод основан на микроскопии, важно следовать всем предупреждениям, связанным с работой с лазерами.
