Наша хирургическая процедура позволяет специфическому редактированию генов лептоменингеальных клеток изучать их функцию во многих физиологических и патологических условиях, таких как нейроразвитие и распространение бактериального менингита. Чтобы свести к минимуму повреждения во время интрацитальной доставки эндоксифена, мы используем изогнутую иглу, которая может быть закреплена против хвостового края черепа, чтобы предотвратить его проникновение глубже в ткани. Процедура может быть использована для зондирования роли генов, выражаюющих лептоменингеальные клетки через потерю и увеличение функциональных экспериментов.
Он также может быть принят для отслеживания потока спинномозговой жидкости. Визуальная демонстрация этого метода обеспечит успешную идентификацию места инъекции для внутритракной инъекции и понимание того, как обезопасить иглу от затылочной кости. Начните с подготовки шприц Гамильтон с 30 калибровочных скошенной иглой для инъекций.
Используйте типсы, чтобы согнуть иглу до 30 градусов в трех миллиметрах от кончика. Далее разбавляют эндоксифен в 10%DMSO до концентрации одного миллиграмма на миллилитр и засовывают шприц. Обезболить животное в изофлюранной камере.
Затем отрегулируйте держатель головы мыши так, чтобы мундштук был примерно под углом 30 градусов от поверхности хирургического стола и зафиксирует голову животного на держателе. Чтобы улучшить доступность цистерны magna, положение тела животного примерно на 30 градусов от поверхности стола с головой наклонена вниз, который установит угол 120 градусов с остальной частью тела и расширить заднюю часть шеи, чтобы облегчить доступ к цистерна magna. После того, как животное правильно расположены, применять офтальмологические мази, брить задней части шеи, и дезинфицировать область с спиртом салфетки и бетадин.
Используйте хирургические ножницы, чтобы сделать разрез средней линии, начиная с уровня затылочной кости и расширения задней. Аккуратно отделить поверхностные соединительной ткани и мышц шеи, потянув боком от средней линии с тонкой кончик пинцетом, который будет подвергать dural мембраны overlying цистерна magna. Позиция небольшой хирургический сепаратор, чтобы визуализация цистерны magna на протяжении всей процедуры.
Определите хвостовой конец затылочной кости и вставьте ранее согнутую иглу прямо под ней. После того, как дура была перфорирована, позвольте согнутому кончику иглы проникнуть под поверхность, аккуратно потянув шприц вверх и параллельно телу животного, что обеспечит лучшую стабильность. Вводить соединение медленно, чтобы избежать вмешательства в естественный поток спинномозговой жидкости.
После инъекции, пусть игла отдохнуть внутри в течение одной минуты, а затем тщательно удалить его с помощью тонкой миппы кончика. Закройте кожу несколькими каплями клея цианоакрилата и нанесите местную анестезию в месте инъекции. Снимите животное с держателя и поместите его в чистую клетку на грелку.
Затем убедитесь, что следить за животным, пока он не приходит в сознание. Intracisternal инъекции эндоксифена у трансгенных мышей, выражающие CreER под Cx30 промоутер, слизистый флуоресцентный репортер позволяет для специфической рекомбинации лептоменингеальных клеток без маркировки соседних Cx30 экспрессии поверхностных астроцитов и паренхимальных астроцитов в коре головного мозга. Этот протокол инъекции использует физиологическое движение спинномозговой жидкости, так что эндоксифен решение распространяется по всему субарахноидального пространства эффективно рекомбинации лептоменинговых клеток наложения обонятельных луковиц, коры и мозжечка.
Раствор не пересекает менингеальный барьер мозга или вступают в контакт с астроглиальными клетками паренхимы, в отличие от системного введения через устные gavage. Рекомбинация лептоменингеальных клеток после интрацистернальной инъекции была выявлена с помощью pdgfr-альфа-реактивности, в то время как поверхностные и паренхимальные астроциты, выражающие Gfap, оставались без маркировки. При попытке этого эксперимента, важно, чтобы найти место инъекции для intracisternal доставки.
Эта визуальная демонстрация обеспечивает техническое ноу-хау для проведения процедуры при минимизации риска повреждения нервной ткани под ним. Исследования абляции генов могут быть выполнены с помощью этого метода для исследования роли лептоменингеальных клеток в кортикогенезе и регуляции формирования спинномозговой жидкости и выявления дополнительных участков для распространения бактерий в субарахноидальное пространство.
